Bir organizmanın tüm ekzom düzeneğinin nükleotit dizisinin, yüksek verimli bir DNA dizileme yöntemi kullanılarak belirlenmesi, tam veya tam ekzom dizileme olarak bilinir. Üç farklı biyomolekül DNA’yı oluşturur, yani pentoz şekeri, azotlu bazlar ve trifosfatlar. Tüm DNA, bir organizmanın genomunu oluşturan kromozomlar üzerinde düzenlenir. Tüm somatik hücreler aynı genoma veya genetik içeriğe sahiptir. Genom, sırasıyla %3 ve %97 DNA kodlayan ve kodlanmayan kısımlar içerir. Kodlayan kısım, farklı proteinleri yapan genler olarak bilinir. Genler, bir dizi ekson artı introndan oluşur ve destekleyici bölge tarafından yönlendirilir.
Burada intronlar, mRNA çevirisi sırasında kaldırılan kodlayıcı olmayan dizilere müdahale ediyor. Protein olan son ürünü yapmak için sadece eksonlar orada kalır. Yalnızca kodlayan eksonları sıralamak için kullanılan teknik, ekzom dizileme olarak bilinir. Bu, bir ekzomun ne olduğu ve tüm ekzom sıralama platformunun nasıl çalıştığı hakkında bilgileri içerir.
İçindekiler
ekzom nedir?
Yalnızca bir genin eksonları protein üretebilir ve üst üste binen diziler, transkripsiyon sırasında çıkarılır, bu nedenle son mRNA’nın oluşumunda yer almaz. Bir gen yalnızca bir ekzondan oluşmaz, aynı zamanda gende bir veya daha fazla ekson içerir. Genomdaki tüm eksonlar “ekzom” veya “tam ekzom” olarak bilinir. Başka bir deyişle, bir organizmanın genomunun tüm genlerinin yalnızca bir kodlama bölgesi, “ekzom”, “ekzom topluluğu” veya “tam ekzom” olarak bilinir. Ekzom tüm genomun sadece %2’sini içerir.
Genelde gen kodlayan bölgelerde meydana gelen mutasyonlar daha zararlıdır. Böylece, tüm ekzomun dizilimini yaparsak, mutasyona uğramış ekson, bununla ilişkili genetik hastalık ve fenotipik etkisi hakkında bilgi elde edilebilir. İnsan genomunda, toplam genomun %1 ila 2’sini oluşturan toplam 180.000 ekzon vardır.
Tam ekzom dizilimi nedir?
Dizi bilgisi elde etmek için DNA dizilemesi yapılır. Dizileme makinesi, bir hedef dizide veya gende bulunan her bir nükleotidi tanımlar ve tespit eder. Tüm ekzom dizileme, genomun tüm kodlama bölgesini dizileyecek kadar güçlü, yeni nesil yüksek verimli bir DNA dizileme teknolojisidir. İlk dizileme yöntemi Sanger tarafından geliştirildi ve Sanger dizileme yöntemi olarak biliniyor ve halen laboratuvarlarda 1000 ila 1500 nükleotit uzunluğundaki daha küçük DNA parçalarını dizilemek için kullanılıyor. Ancak tüm genom dizileme için Sanger’in yöntemi o kadar hızlı değil; Birkaç yıl sürer! Öte yandan, yeni nesil dizileme yöntemi o kadar hızlı ki, 3 milyar bazdan oluşan tüm bir genomu bir günden bir haftaya kadar dizileyebiliyor. Tüm ekzom sıralama yöntemi, tüm ekzom düzeneğini sıralayabilir. Bu nedenle, hastalığa neden olan varyantların %85’inden fazlası dizilenebilir veya tespit edilebilir.
Kodlama bölgelerindeki mutasyon daha zararlı kabul edilir ancak kodlama bölgesi dışındaki bazı mutasyonlar da kişinin sağlığını olumsuz etkileyebilir. Örneğin IVS 1-5 ve IVS1-1 mutasyonu beta talasemi için gösterilebilir. Bununla birlikte, genetik hastalıklarla ilişkili mutasyonların, değişikliklerin ve kopya sayısı farklılıklarının %80’den fazlası kodlama bölgelerinde, bileşiklerde ve ekzomlarda bulunur. Bir grup ekzomu sıralamak, tüm genomu sıralamaktan daha uygundur. Tüm genom dizilimi daha uzun sürer ve aynı zamanda daha pahalı bir süreçtir. Sonuç olarak, tüm ekzom dizileme teknolojisi, düşük maliyetli denemelerde bir hastalıkla ilişkili farklı alellerin varyantlarını veya lokusları bulmak gibi iki sınırlamanın üstesinden gelmek için gelişmiştir. Spesifik olarak, yalnızca protein kodlayan bölgeleri değil, aynı zamanda diğer mikroRNA’ların veya lincRNA’ların ekzonlarını da sıralar.
Tüm ekzom sıralama süreci
Bu dizileme platformunun süreci, yeni nesil dizilemeye veya diğer yüksek verimli dizileme yöntemlerine biraz benzer. Süreç oldukça karmaşıktır, ancak basitçe açıklamak gerekirse, süreç şu şekilde tarif edilebilir:
izolasyon aşaması
İlk olarak, tuzdan arındırma yöntemi kullanılarak yüksek kaliteli DNA izole edilir veya DNA ekstraksiyon yöntemi kullanıma hazırdır. Bununla birlikte, Exome dizilimi için üretici tarafından DNA ekstraksiyon yöntemi şiddetle tavsiye edilir. Tüm ekzom dizilemesinde kullanım için, herhangi bir DNA ekstraksiyon yöntemiyle iki kriter karşılanmalıdır; biri, DNA kalitesinin 1,80 civarında olması ve miktarının 100-250 ng olması gerektiğidir. DNA ekstraksiyonunu, hedeflenen bir zenginleştirme işlemi takip eder. Hedeflenen zenginleştirme sürecinde, tüm ekzom düzeneği DNA örneğinden izole edilir. DNA sindiriminin fiziksel veya enzimatik yöntemleri, hedeflenen zenginleştirmeden önce gerçekleştirilir.
DNA fragmantasyonu söz konusu olduğunda, DNA fragmanları yapmanın amacı, testin karmaşıklığını azaltmaktır. Daha büyük DNA fragmanlarının dizilenmesi daha zordur ve bundan böyle daha küçük DNA fragmanları sentezlenir ve bir kütüphanede toplanır. Kütüphane, DNA’nın tüm parçalarının bulunduğu bilinen bir yerdir. Parçalanmış DNA, kör uçların üretildiği ve adaptörlere bağlandığı kitaplık hazırlığında işlenir.
hedef zenginleştirme aşaması
Hedef zenginleştirme, incelemek veya sıralamak istediğimiz genomik bölgeleri, bu durumda ekzomları seçmek için kullanılan yöntemlerden veya yöntemler dizisinden başka bir şey değildir. Dizi tabanlı yakalama veya çözünürlüklü yakalama gibi yöntemleri kullanarak, Exomes gibi sıralamak istediğimiz bölgeleri belirleyebilir ve izole edebiliriz. Sekans tabanlı yakalama yöntemi, bir DNA dizisini hedefleyen bir probun belirli bir katı yüzeye eklendiği geleneksel yöntemlerden biridir. Ekzom dizileri (tamamlayıcı dizileriyle birlikte) her bir prob üzerinde hibridize edilir ve daha sonra PCR’de amplifiye edilir.
Bununla birlikte, geleneksel mikrodizilerde olduğu gibi kör uçlar üretme, bağdaştırıcı bağlama ve yıkama gibi adımlar da dahildir. Ön sıralama bilgisi gereklilikleri, hantal numune işleme, kullanımı zorlaştırır. Solüsyon yakalama yönteminde problar, DNA fragmanının hibridize edildiği bir solüsyon (boncuklar veya manyetik boncuklar) içindedir. Kalan hibritleşmemiş DNA yıkanır ve ilgili DNA fragmanlarını içeren pelet düzenlenir. Yani bunlar, ekzom dizilimi için hedef zenginleştirme yapmanın iki yolu. Numune hazırlama tamamlandıktan sonra bir yıkama adımı gerçekleştirilir ve ardından kütüphane saflaştırılır. DNA’yı, sıralamak istemediğimiz ekson parçalarına ve diğer DNA parçalarına sahip olacak şekilde böldük. Yıkama, tüm gereksiz DNA’ların yanı sıra diğer kimyasalların izlerini de ortadan kaldırır. Örneği ayırarak, DNA dizilimi için saf bir ekzon fragmanları kütüphanesi hazır olur.
Kitaplık sıralama için işleniyor. Dizileme makinesi, tüm exome kitaplığından her diziyi okur ve bunları sinyal olarak verir. Yüksek verimli paralel sıralama, büyük ölçüde kısa satırlara yönelik milyonlarca okuma elde etmek için gerçekleştirilir. Kısacası, köprü amplifikasyon sürecinde, tüm mekanizma olan NGS’deki her uzatma adımından sonra her ddNPT tespit edilir. Bilgisayar programı her bir nükleotidi sırayla düzenler ve her parçanın sırasını belirler. Kitaplık düzenlemelerine bağlı olarak, tek tek parçalar sıralanır ve tüm ekzom dizilimi bilgisayar tarafından oluşturulur.
Tüm ekzom sıralamasının avantajları ve uygulamaları
Mevcut sıralama yöntemi oldukça verimli, hızlı, güvenilir, uygun maliyetli ve nispeten doğrudur. Genomun tüm kodlama bölgesini kapsar. Dizileme verileri, 90 ila 100 GB tüm genom dizileme ile karşılaştırıldığında yalnızca 4 ila 5 GB çıktıdır. Hastalıkla ilişkili bilinen genotipler ve aleller için kullanılır. Anormallikle ilişkili kodlama bölgelerindeki değişikliği bulmada etkilidir. Genetik hastalıkların taranmasında, yeni varyasyon ve mutasyonların tanımlanmasında, popülasyon genetiğinde, kanser genetiğinde ve diğer alanlarda kullanılmaktadır.
Mevcut yöntem çok doğrudur ve bu nedenle sıklıkla poligenik hastalıklar için kullanılır. Örneğin, Kabuki hastalığı, kalıtsal paroksismal diskinezi, konjenital klorür ishali ve spinocerebellar ataksi için genetik mutasyonlar, tüm ekzom dizilimi ile taranır. Mendel hastalığı ile ilişkili yeni varyantların keşfinde, nadir varyantların tanımlanmasında ve gen haritalamada da uygulanabilir.
Tüm ekzom sıralamasının dezavantajları ve sınırlamaları
Exome dizileme, en yeni DNA dizileme teknolojisidir, ancak çok önemli bir sınırlaması vardır. İlk olarak, hastalığa neden olan mutasyonların tümü ekzonlarda yer almaz. Bir hastalık veya hastalık grubuyla ilişkili çok çeşitli mutasyonlar keşfedilmiş olsa da, bazıları varlığını sürdürüyor. Tüm genomdaki mutasyonları, değişiklikleri veya kopya varyasyonlarını kapsaması mümkün olmayan av tüfeği dizileme veya klonlama dizileme yoluyla klonlama gibi bir tam genom dizileme yöntemi gereklidir. Mevcut yöntemin bir başka sınırlaması, bazı eksonların dizi benzerliğidir. Tüm ekzonlar aynı değildir, ancak bazıları da farklı değildir! Birçok ekson, diğer ekzonlar arasında paylaşılan tekrarlayan DNA dizilerine sahiptir. Kesin olarak tahmin edilemez.
Tüm ekzom sıralama yöntemi, WGS’ye kıyasla daha hızlı, daha ucuz ve daha doğrudur. Sadece mRNA’ların değil, aynı zamanda siRNA ve miRNA’nın ekzomlarının dizi bilgilerini de verebilir. Ancak, sonuçları elde etmek için kapsamlı bilgisayar bilgisi, yüksek hızlı süper bilgisayarlar ve uzman insan gücü gereklidir. Ayrıca, sıkıcı yer değiştirme adımlarına gerek yoktur. Exome sıralama akademisyenler, araştırmacılar ve akademisyenler için yararlıdır. Hastalığın teşhisi, prognozu ve patofizyolojisi de analiz edilebilir. Mevcut yöntem, nadir görülen Mendelyen veya Mendelyen olmayan bozuklukları incelemek ve hastalığa neden olan nadir genetik varyantları bulmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Küçük bir popülasyonda bulunan varyantlar da tespit edilebilir.
kaynak:
https://ghr.nlm.nih.gov/primer/testing/sequencing
https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/targeted-resequencing/exome-sequencing.html
http://www.biocompare.com/Eduments-Articles/354629-Exome-Sequencing-vs-Whole-Genome-Sequencing/
yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]