Hücre canlılığı ve sitotoksisitenin florimetrik deneyleri, bir floresan mikroskobu, florometre, floresan mikroplaka okuyucu veya akış sitometresi kullanılarak kolaylıkla gerçekleştirilebilir. Geleneksel boya dışlama ve kolorimetrik analizlere göre birçok avantaj sunar. Florometrik deneyler, yapışık veya asılı hücre hatları için uygulanabilir ve kullanımı kolaydır. Bu testler kolorimetrik testlerden daha hassastır. Ticari florometrik analiz kitleri birkaç şirketten temin edilebilir ve bu tahliller için deneysel prosedürler genellikle alet paketlerinde bulunur.
İçindekiler
AlamarBlue (AB) Testi
AlamarBlue testi aynı zamanda resazurin azaltma testi olarak da bilinir. Bu tahlil, mitokondri ve diaforazlar gibi diğer enzimler tarafından pembe floresan resorufine dönüştürülen floresan olmayan mavi boya resazurinin dönüştürülmesine dayanır.
Resazurin, tetrazolyum bileşiklerini kullananlara benzer protokoller kullanarak canlı hücrelerin sayısını izlemek için kullanılabilen bir fenoksazin-3-on boyası ve hücre geçirgen redoks göstergesidir. Elektron alıcısı olarak moleküler oksijeni ikame ederek, oksijen ve sitokrom c oksidazın nihai redüktazı arasındaki elektron taşıma zincirinde bir ara elektron alıcısı olarak hareket ettiği bilinmektedir. Toksik olmayan, hücre geçirgen bir bileşik olduğu için mavi renktedir ve flüoresan değildir. Hücrelere girdikten sonra resazurin, resurofen’e indirgenen kırmızı, oldukça floresan bir bileşiktir. Canlı hücreler sürekli olarak resazurini, hücre kültürü ortamının genel floresanını ve rengini artıran resforine dönüştürür. Üretilen rezoforin miktarı canlı hücre sayısı ile ilişkilidir. Canlı hücrelerin oranı, 560 nm/590 nm emisyon filtre düzeneği ile donatılmış bir mikroplaka okuyucu florimetre kullanılarak ölçülebilir. Resovorin aynı zamanda absorbans değişiklikleriyle de ölçülebilir, ancak absorbans saptaması florometriden daha az hassas olduğu için absorbans saptaması sıklıkla kullanılmaz.
Arka plan üzerinde yeterli bir floresan sinyali oluşturmak için gereken inkübasyon süresi, hücrelerin metabolik aktivitesine, oyuk başına hücre yoğunluğuna ve kültür ortamı türü gibi diğer koşullara bağlı olarak genellikle yaklaşık 1-4 saattir.
Avantajlar
AlamarBlue (resazurin indirgeme) testi nispeten ucuzdur ve tetrazolyum testlerinden daha hassastır. Sitotoksisite mekanizması hakkında daha fazla bilgi toplamak için kaspaz aktivitesini ölçmek gibi başka yollarla da artırılabilir.
Negatifler
Test bileşiklerinden olası flüoresan etkileşimi ve genellikle göz ardı edilen hücreler üzerindeki doğrudan toksik etkiler.
CFDA-AM testi
CFDA-AM (5-karboksifloresein diasetat, asetoksimetil ester), sitotoksisiteyi belirlemek için kullanılan başka bir floresan boyadır ve plazma zarı bütünlüğünün bir göstergesidir. CFDA-AM boyası, canlı hücrelerden spesifik olmayan esterleştirmelerle zar geçirgen, polar olmayan, flüoresan olmayan bir maddeden polar, flüoresan, karboksifloresein (CF) boyaya dönüştürülebilen toksik olmayan bir esteraz substratıdır. . CFDA-AM’nin hücreler tarafından CF’ye dönüştürülmesi, plazma zarı bütünlüğünü gösterir. Çünkü sadece bozulmamış bir zar, esteraz aktivitesini desteklemek için gerekli olan sitoplazmik ortamı koruyabilir.
Avantajlar
Hem CFDA-AM hem de alamar Blue testleri hücreler için zararlı değildir. Bu arada inkübasyon süreleri aynı olup, farklı dalga boyları ile girişim gerektirmediği belirlendiğinden, aynı hücre setinin paralel olarak tedavi edilebileceğine karar verilmiştir.
Negatifler
Test bileşiklerinden flüoresan girişim mümkündür.
Proteaz duyarlılık belirteç testi (GF-AFC testi)
Canlı hücrelerin korunmuş ve biçimlendirici proteaz aktivitesinin ölçümü, hücre canlılığının iyi bir göstergesi olarak kullanılır. Canlı hücrelerle sınırlı proteaz aktivitesinin seçici tespiti için hücreye izin veren bir florojenik proteaz substratı (glisilfenilalanil-aminoflorokumarin; GF-AFC) geliştirilmiştir. GF-AFC substratı canlı hücrelere nüfuz edebilir. Bu hücrelerde, sitoplazmik aminopeptidaz aktivitesi, aminoflorokoumarin (AFC) salmak için gli ve phe amino asitlerinin çıkarılması sırasında canlı hücrelerin sayısıyla orantılı bir floresan sinyali üretir.
Hücreler öldüğünde, bu proteaz aktivitesi hızla kaybolur. Bu nedenle, bu proteaz aktivitesi, canlı bir hücre popülasyonu için seçici bir belirteçtir. Bu tahlil yaklaşımı tarafından üretilen sinyalin, ATP tahlili gibi hücre yaşayabilirliğini belirlemek için diğer yerleşik yöntemlerle iyi bir korelasyon gösterdiği gösterilmiştir.
Avantajlar
Kültürdeki hücreler için nispeten toksik değildir. Ayrıca, hücrelerin trazollium’a maruz kalmasının aksine, hücrelerin bir GF-AFC substratına uzun süre maruz kalması, hücre canlılığında çok az değişikliğe neden olur. Bu tahlil, diğer tahlillerle çoğullama için uygundur çünkü tahlilin sonunda hücre popülasyonu canlı kalır ve daha fazla test için kullanılabilir. Ayrıca inkübasyon süresi tetrazolyum testleri için gerekli olan 1-4 saate kıyasla çok daha kısadır (30 dk-1 saat).
Negatifler
Test bileşiklerinden flüoresan girişim mümkündür.
Luminometri testleri
Fotometre tahlilleri, memeli hücrelerinde hücre proliferasyonu ve sitotoksisitenin hızlı ve basit bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu testler, 96 ve 384 oyuklu mikrotiter plaka dostu formatta gerçekleştirilebilir ve aydınlatmalı bir mikroplaka okuyucu kullanılarak tespit edilebilir. Fotofotometri deneylerinin dikkate değer bir özelliği, reaktif ilavesinden sonra üretilen tutarlı ve kararlı ışıma tipi sinyaldir. Bu özellik, aynı kuyudan canlılık ve sitotoksisite değerleri üretmek için kullanılabilir. Fotometrik tahliller için ticari kitler birçok şirketten temin edilebilir ve bu tahliller için deneysel prosedürler genellikle araç paketlerinde bulunur.
ATP testleri
ATP (adenozin trifosfat) hücrelerdeki en önemli kimyasal enerji deposudur ve biyosentetik süreçlerde, sinyalleşmede, taşımada ve harekette kullanılır. Bu nedenle hücresel ATP, hücre canlılığını ölçmek için en hassas son noktalardan biridir. Hücreler ölümcül şekilde hasar gördüğünde ve zarları bütünlüklerini kaybettiğinde, ATP sentezleme yeteneklerini kaybederler ve hücrelerdeki ATP seviyesi önemli ölçüde düşer. ATP testi, lusiferinin oksilusiferin ile etkileşimine dayanır. Lusiferaz enzimi bu reaksiyonu Mg2+ ve ATP iyonlarının varlığında katalize ederek parlak bir sinyal verir. Işıldayan sinyalin yoğunluğu ile ATP konsantrasyonu veya hücre sayısı arasında doğrusal bir ilişki vardır.
ATP tahlil kimyaları tipik olarak oyuk başına 10’dan az hücre saptayabilir ve bu nedenle yaygın olarak 1536 oyuklu bir plaka formatında kullanılır.
Avantajlar
ATP testi, kullanımı en hızlı hücre canlılığı testidir ve diğer canlılık testleri arasında en hassas ve en az yapay olanıdır. Lüminesan sinyal sabit bir duruma ulaşır ve reaktif eklendikten 10 dakika sonra stabilize olur. Substratı renkli bir bileşiğe dönüştürmek için herhangi bir inkübasyon adımı yoktur. Bu aynı zamanda plaka işleme adımını da ortadan kaldırır.
Negatifler
Bir ATP testinin duyarlılığı genellikle bir kimya testi sonucu yerine tekrarlanan örnekleme ile sınırlıdır.
Gerçek zamanlı fizibilite testi
Son zamanlarda, canlı hücre sayısını gerçek zamanlı olarak belirlemek için yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu test, tasarlanmış bir lusiferaz ve deniz karidesinden türetilen küçük moleküllü bir substrat kullanır. Öncü substrat ve lusiferaz, bir reaktif olarak doğrudan hücre kültürü ortamına eklenir. Haberci substrat, bir lusiferaz substratı değildir. Aktif metabolizmaya sahip canlı hücreler, öncüyü, lusiferazın lüminesan sinyali oluşturmak için kullandığı substrata indirger. Test, sürekli okuma ve son nokta ölçümü olmak üzere iki biçimde gerçekleştirilebilir. Sürekli okuma formatında, gerçek zamanlı hücre sayımı tespiti için parlaklık sinyali örnek kuyucuklarından tekrar tekrar kaydedilebilir.
Avantajlar
Bu test, hücre canlılığı ve sitotoksisitenin gerçek zamanlı ölçümüne izin veren tek testtir. Hücre ölümünden sonra ışıldayan sinyaldeki hızlı düşüş, bu tahlilin hücre öldürücü bir parçalama adımı içeren diğer ışıldayan tahlillerle tekrarlanmasına izin verir. Hücre ölümünden sonra lüminesansın azaltılması, müteakip lüminesan analizlerle girişimi ortadan kaldırmak için önemlidir.
Negatifler
Gerçek zamanlı tahlilin sınırlandırılması, pro-substratın metabolik olarak aktif hücreler tarafından nihai olarak tükenmesinden kaynaklanır. Genel olarak, üretilen ışıldayan sinyal, metabolik olarak aktif hücrelerin sayısı ile ilişkilidir. Bununla birlikte, ışıldayan sinyalin hücre sayısı ile doğrusal olacağı süre, oyuk başına hücre sayısına ve bunların metabolik aktivitesine bağlıdır. Bu nedenle, lineerliği korumak için her hücre tipi ve tohumlama yoğunluğu için maksimum inkübasyon süresinin ampirik olarak belirlenmesi önerilir.
3. Sonuçlar
Şu anda toksikoloji ve farmakoloji alanlarında çok çeşitli sitotoksisite ve hücre canlılığı deneyleri kullanılmaktadır. İdeal bir in vitro hayatta kalma testi veya sitotoksisite tayini hızlı, güvenli, güvenilir, verimli ve zaman ve maliyet açısından etkin olmalıdır. Test bileşiği ile etkileşime girmemelidir ve tahlil yönteminin seçimi, reaksiyon tipini değerlendirmede kritik öneme sahiptir. Tahlil, karmaşık reaksiyonun yorumunu değiştirebilir. Bu nedenle, test bileşiğinin etki mekanizması dikkate alınarak test yöntemi dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Çalışmada kullanılan doku veya hücre tipi de sitotoksisite deneylerinin performansını ve hücre canlılığını etkiler. Bu nedenle, çalışmak için bir sınav seçmeden önce, farklı yöntemleri denemeli ve karşılaştırmalısınız. Mümkünse, in vitro çalışmalarda sitotoksisite ve hücre canlılığını belirlemek için birden fazla test kullanılmalıdır. Bu da elde edilen sonuçların güvenilirliğini arttırır.
kaynak:
ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27509942
sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123918604000033
yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]