Son yıllarda DNA dizileme teknolojisinin kullanım alanları artmıştır. başlıca kullanım alanları; Genom montajı, tek genom yeniden düzenlemesi, klinik dizileme ve dizileyicilerin moleküler sayma makinelerine dönüştürülmesi.
Genom Topluluğu
Tüm genom, oldukça uzun bir DNA dizisidir. Bu nedenle, genom tek seferde baştan sona dizilenemez. Bu nedenle genom, eksonükleaz enzimleri tarafından daha küçük parçalara bölünür. Her parçanın sırası çıkarılır. Tüm genom dizisi, bir yapboz gibi bilinen bir dizinin parçalarının doğru bir şekilde birleştirilmesiyle elde edilir. Bu sürece genom montajı denir. 25 yıl önce, genom dizileme teknolojilerinin temel amacı, genomun bir kısmını veya tamamını dizilemekti. 1977’de Sanger dizilemesinin ortaya çıkmasıyla, genomlar ilk kez insanlar tarafından toplandı. DNA dizisi rastgele ise, yalnızca DNA segmentlerindeki örtüşen noktalara dayalı olarak büyük genomlar keyfi olarak yapılabilir. Ancak DNA dizisi rastgele değildir. DNA’daki tekrarlayan dizilerin kombinasyonu ve teknik zorluklar, büyük genomların iyi bir şekilde bir araya getirilmesini imkansız hale getiriyor. Bu nedenle, fragmanlardaki dizileri eşleştirmek için dizinin ek bir ortak noktasına ihtiyaç vardır.
Bu ek afinite bilgisi İnsan Genomu Projesi’ne şu şekilde sağlanmaktadır: 1) Genetik polimorfizmlerin (DNA dizilerindeki çeşitlilik) soy ağacındaki dağılımına dayalı genetik haritalar aracılığıyla bilgi elde edilmiştir. 2) Restriksiyon enzimleri kullanılarak genom fragmantasyonu sonucunda elde edilen fragmanların durumuna göre genom kaynaştırıldı. 3) 1990 yılında Ansorge tarafından geliştirilen bir teknik kullanılarak, bilinen uzunluktaki DNA fragmanlarının uçları düzenlendi ve diğer fragmanlarla karşılaştırıldı. Klonlama yöntemine bağlı olarak, uzunluk birkaç bin bazdan birkaç milyon baza kadar değişebilir. Bu yollarla sıralamadaki hata 100.000’de 1 baza düşürülür.
Genom dizilimi sırasında, DNA parçalarını bir araya getirmek için bazı bilgisayar algoritmaları kullanılmaya başlandı. Bu konuda önemli bir gelişme de phrap kompleksi ve TIGR gibi algoritmalardan sonra Celera karmaşık graf tabanlı yaklaşım (overlap-planning-consensus) algoritmasının geliştirilmesidir. Celera ile işbirliği içinde, İnsan Genom Projesi’nde yüksek kaliteli bir referans genom ortaya çıkarıldı. Bir referans genomun elde edilmesi, genom birleştirme süreçlerinde kullanım için genomun karşılaştırılmasına izin verir. Mevcut dizilemede kullanılan insan referans genomu, 2004 yılında elde edilen diziden türetilmiştir. Bu referans genom, Referans Genom Konsorsiyumu’nun çalışmasıyla geliştirilmiştir. Aynı kurum, referans genom hakkında düzenli güncellemeler yayınlamaktadır.
Genom yeniden dizilimi
İnsan Genomu Projesi’nden sonraki adım, insanlar arasındaki genetik varyasyonları (DNA’nın kişiden kişiye farklılık gösteren alanları) yeniden sıralamak, kataloglamak. İnsanlardaki genetik varyasyonların tanımlanması, genetik hastalıkların mekanizmasının anlaşılması, teşhis ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından oldukça önemlidir.
Genetik varyantları tanımlamak için yeniden dizilemede okunan fragmanları referans genomla karşılaştırmak anlamına gelir. Bu süreç, genom montajından tamamen farklıdır. Papyon ve Burrows-Wheeler Aligner (BWA) gibi yeni algoritmalar, milyonlarca okumanın (DNA fragmanlarının dizileri) bir referans genomla eşlenmesine izin verir.
İnsan Genom Projesi’ndeki insan genomu, mozaik DNA donörlerinden üretildi. Çoğunlukla New York’ta yaşayan eşit Avrupa ve Afrika kökenli bir kişiden alınmıştır. 2007’de Craig Venter, tüm genom dizilimini yapan ilk kişiydi. Ardından, 2008’de Jim Watson’ın genomu dizilendi. Tüm genom dizilimi o zamanlar çok pahalıydı ve araştırmalar, genomun yalnızca %1-2’sinin proteinleri kodladığını ortaya çıkardı.
Tüm genom dizilemesini 1.000 dolara ve tam ekzon dizilemesini (genomun protein kodlayan kısımları) birkaç yüz dolara düşürmek, insan genom dizileme uygulamalarını hızlandırdı. Ekzon dizileme projesi ile 2013 yılında 6.500 ekson dizilenmiştir.
Dizilemenin klinik uygulamaları
Son yıllarda, insan genomunu dizileyen ve insandaki varyasyonları yorumlayan teknolojiler hızla gelişti. DNA dizilemenin klinik uygulama alanlarından biri, invaziv olmayan doğum öncesi testler. 2008 yılında yapılan bir çalışmada annenin dolaşımında fetal DNA tespit edilmiş ve bu sayede fetüsteki kromozomal anormallikler tespit edilmiştir. Tarama testleri hızla bu stratejiye uyarlandı. Bu strateji ile yapılan testler sayesinde anne adayları fetüste genetik bir anormallik olup olmadığını öğrenebilirler. Bugüne kadar, dünya çapında birkaç milyon hamile kadın bu testi yaptı.
Tam ekson dizilemenin (WES) ilk uygulaması, hastalıklarda yeni genlerin keşfedilmesi ve teşhis yöntemlerinin geliştirilmesidir. Bu keşifleri, nörogelişimle ilgili hastalıklarda kodlama dizilerindeki mutasyonların keşfi takip etti. WES, dünya çapında genetik hastalıklar için bir teşhis yöntemi olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır.
Genetik bir hastalık olan kanser anlayışımız da DNA dizileme teknolojisi ile giderek değişti. Kapsamlı yeniden dizileme, kanserin önemli genetik heterojenite (farklı genler ve mutasyonlarla ilişkili) gösterdiğini ortaya çıkardı. DNA dizileme, klinik kanser tedavilerini çeşitli şekillerde etkilemiştir. Bu teknoloji ile her kanser türünde mutasyonları hedef alan tedaviler geliştirilmektedir. Ayrıca kanser teşhisi için biyopsi gibi invaziv yöntemler yerine non-invaziv tanı yöntemlerine, tümör-kök hücreler ve kandan arındırılmış DNA elde edilerek dizileme yoluyla tanıya olanak sağlar. Ayrıca kansere neden olan mutasyonlardan kaynaklanan parçalanmış proteinler de antijen olarak kullanılır. Bu sayede ilgili kanser türü için spesifik bir kanser aşısı geliştirilebilir.
Parçacık sayaçları olarak sıralayıcılar
Genlerin aktivitelerini belirlemek için ürettikleri RNA ve protein miktarına bakmak gerekir. Sıralama teknolojisi geliştikçe, RNA bu şekilde ölçülebilir. Ancak RNA, işlemeye DNA’dan daha duyarlı olduğu için özel bir enzim tarafından cDNA’ya dönüştürülür. cDNA’ların uçları sıralanır ve bir etiket gibi veritabanlarına kaydedilir. Bu şekilde, genlerden RNA üretimi, cDNA’ların dizilenmesi ile belirlenir. Bu işleme RNA dizilemesi denir. Bu yöntem, kalıtsal hastalıkların varlığında gen aktivitesindeki değişikliği araştırmamızı sağlar.
Klinik uygulamaların yanı sıra çevrede ve insan vücudunda bulunan bakterilerin DNA’larında da dizileme yapılmaya başlanmıştır. Böylece metagenom adı verilen yeni bir alan ortaya çıktı.
Nüfus çapında sıralama
Bugüne kadar, yaşayan insanların %0,1’inin genomu dizilendi. Ayrıca insan atalarının ve diğer antik insanlarla akraba türlerin genomlarının dizilenmesi insanlık tarihine ışık tutacaktır. Ayrıca dizileme adli tıp alanında da kullanılmaktadır. örnek; Bir kişinin kanının veya herhangi bir vücut sıvısı örneğinin DNA dizilimi, örneğin hangi taraftan olduğunu ortaya çıkarabilir.
Gelişimsel Biyoloji
Her birimiz tek bir hücreden köken alan trilyonlarca hücreden meydana geldik. Ancak, gelişme anlayışımız yüzeyseldir. Ancak genom dizileme ve genom manipülasyon teknolojilerinin gelişmesi bu konuda daha fazla bilgiye erişmemizi sağlıyor. örnek; Hücreler tarafından yapılan RNA ve proteinler arasındaki farklar ve organizmaların farklı gelişim aşamalarındaki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimler ortaya çıkarılabilir.
Sıralama teknolojileri, bilimden adli tıbba kadar geniş bir uygulama alanına sahiptir. Özellikle genetik hastalıkların mekanizmasının anlaşılmasında ve sağlık alanında teşhis ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde vazgeçilmez bir teknoloji haline gelmiştir. Gelecekte bu teknolojinin kullanılacağı yeni alanların ortaya çıkması ve yaygınlaşması da mümkündür.
Kaynak:
1) Şendure ve Ark. 40 Yaşında DNA Sıralaması: Geçmiş ve Bugün
Ve gelecek. doi: 10.1038/nature24286.
yazar: Ayka Olkay
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]