Çeşitli endüstriyel amaçlar için yaygın olarak kullanılan aktinomisetler gibi farklı ve büyük miktarlarda enzimler vardır. Enzimlerin spesifik özellikleri, endüstriyel işlerde reaksiyonların daha ılıman koşullar altında, daha iyi verim ve daha az atıkla gerçekleştirilmesine izin verir. Doğal enzimlerin daha fazla yeniden yapılandırılması kritiktir, çünkü genellikle biyokatalitik süreçler için uygun değildirler. Son zamanlarda, genomik, metagenomik, proteomik, verimli ekspresyon sistemleri ve ortaya çıkan rekombinant DNA’daki en son gelişmelerle eş zamanlı olarak yeni mikrobiyal ve doğal enzimler keşfedilmiştir.
Enzim biyoteknolojisinin devam eden gelişimi, endüstriyel biyokataliz alanını geliştirmeye yardımcı olmaktadır. Termofilik aktinomisetler, endüstriyel işlemlerde yaygın olarak kullanılan termostabil enzimler üretir. Aksine, aktinomisetler daha düşük sıcaklıklarda iyi gelişir ve sonuç olarak enzimleri daha düşük sıcaklıklarda daha etkilidir. Gelişmiş DNA dizileme teknolojisi, endüstride yaygın olarak kullanılan proteinleri oluşturan tüm genlerin dizisini ve işlevlerini belirlemeyi ve ölçmeyi mümkün kılar. Rekombinant suşlar, enzim üretimini büyük ölçekte artırmak için bazı biyoteknolojik araçlar kullanılarak elde edilebilir.
Enzim özellikleri, talep arttırılarak geliştirilebilir. Endüstriyel enzimler, endüstriyel ölçekte üretim elde etmek için genellikle daha fazla ince ayara ihtiyaç duyar. Üretimin 100 kat artması nedeniyle rekombinant DNA teknolojisinin büyük endüstriyel ölçeklerde acilen kullanılmasıdır. Enzim modifikasyonunun, işlevlerini rasyonel yeniden tasarım ve füzyon yaklaşımlarıyla uyarlamanın iki ana yolu vardır. Bu iki ana yöntem şu şekildedir:
İçindekiler
Rasyonel ve yenilikçi tasarım
Bu strateji, enzimatik reaksiyonun 3 boyutlu yapısı ve kimyasal mekanizması hakkında tam bilgi gerektiren amino asit ikamelerine erişmek için doğrudan mutajenez kullanımına dayanır. Veritabanları protein yapılarını ve dizilerini içerir, bu nedenle yeni enzim dizilerinin referanslarla karşılaştırılması, işlevleri veya yapıları zaten bilinen ilgili enzimleri tanımlayabilir.
kombinatoryal yöntemler
Kombinatoryal yöntemler, kiralite, biyokatalitik etki, kataliz hızı, çözünürlük, özgüllük ve stabilite gibi bir enzim molekülü ile ilişkili belirli faktörlere bağlıdır. Bu yöntemler, yeni enzim bulma yöntemlerinden daha hızlı ve daha ucuzdur ve belirli koşullar altında doğal yöntemlerden daha iyi davranırlar. Yönlendirilmiş evrim olarak da adlandırılan kombinasyonel yöntemler, PCR, tekrarlanan oligonükleotide yönelik mutajenez ve kimyasal maddeler gibi çeşitli teknikler kullanılarak bir protein kodlayan gende rastgele mutasyonlara sahiptir.
PCR teknolojisi, çok sayıda enzimdeki rastgele ve noktasal mutasyonları saptar. Bu teknikler, tipik olarak %70’in üzerinde homolojiye sahip ebeveyn genleri arasında rastgele in vitro rekombinasyon gerçekleştirir. Nokta mutasyonu, hedef aktif bölge kalıntıları (yaklaşık 10-15 amino asit) ve bunlara en yakın olanlar (20-30 amino asit daha) tarafından gerçekleştirilir.
CAS Ting adı verilen başka bir yöntem, kitaplıkların aktif bölge kalıntılarından yapılmış iki veya üç kalıntının kombinasyonlarından oluşturulduğu kombinatoryal aktif bölge analizine dayanır. PCR çalıştırıldığında amino asit alfabesi küçülür ve sadece 12 amino asitten oluşan yeni proteinler sentezlenir. Diğer teknikler, ekzonlar veya karışık alanlar, döngü bölgeleri, rastgele kesme veya kodonların eklenmesi ve silinmesidir. Ayrıca rastgele yeniden tasarlama tekniği, daha yüksek aktiviteye, farklı pH değerlerinde ve sıcaklıklarda daha fazla stabiliteye, artan simetriye, değişken substrat özgüllüğüne ve organik çözücülerde stabiliteye sahip yeni ve geliştirilmiş enzimler oluşturmak için kullanılır.
Protein farmasötiklerinin ve biyolojik makromoleküllerin yeni bir substrat özgüllüğü, aktivitesi, artan biyolojik aktivitesi vardır. Yönlendirilmiş evrim yöntemi, glifosat-N-asetiltransferaz aktivitesini 10.000 kat ve termal stabiliteyi 5 kat artırabilir. Yönlendirilmiş bir evrim çalışması, 2000’den beri piyasaya yeni ve geliştirilmiş enzim proteinleri getirdi.
Rekombinant mikrobiyal proteinlerin üretimi
Moleküler biyoloji teknikleri, özellikle rekombinant DNA, çeşitli mikroorganizmalar tarafından enzim üretimi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. bazı farklı mikroorganizmalar; Bacillus türleri, ralstonia eutropha, pseudomonas fluorescens, saccharomyce cerevisiae, pichia pastoris, hansenula polymorpha, aspergillus türleri, trichoderma ve E. coli.
İkincisi, doğru genom modifikasyonları, hızlı büyümeleri ve farklı ortamlarda iyi büyümeleri nedeniyle bu amaç için kullanılan en yaygın bakterilerdir. Ayrıca, Pfenex’in pseudomonas fluorescens’i 20 g/L protein üretebilir. Saccharomyces cerevisiae ise üreme için sıklıkla konakçı olarak kullanıldığı için bakterilerden daha faydalıdır.
Yüksek hücre yoğunluğuna sahiptir, heterolog proteinler üretir ve diğer ökaryotlardan daha genetik olarak gelişmiştir. Bahsedilen tüm faydalara rağmen bu maya, büyük ölçekli memeli protein endüstrisinde kullanıma uygun değildir. Aşırı glikosilasyon, a-1,3-mannoz kalıntılarının birikmesinden kaynaklandığından, hastalardaki antijenik yanıt, güçlü ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş uyaran eksikliğidir. P. pastorisen yaygın bir endüstriyel mikroorganizmadır ve 700’den fazla protein üretebilir. Rekombinant protein verimi, hücre içi proteinler için 22 g/L ve salgılanan proteinler için 14.8 g/L içeriyordu.
P. pastoris, 30 g/L’ye kadar rekombinant protein üretebilir. DNA rekombinasyon teknolojisi daha kolay ve daha hazır olmasına rağmen, gen ekleme ve silme zorlu olmaya devam ediyor. Endüstriyel ölçekteki sorun, mikotik olmayan protein üretiminin homolog proteinlere kıyasla düşük olmasıdır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, zayıf proteaz suşları oluşturmak, çok sayıda gen kopyası eklemek, güçlü mantar indükleyicileri kullanmak, verimli salgılama sinyalleri ve transgen gibi çeşitli stratejiler vardır. İyi salgılanan proteinin bir kısmını veya tamamını kodlayan bir gen ile bir füzyondur. Chrysosporium şansının büyük bir protein üretme kapasitesine (50-80 g/l) sahip olduğu ve bundan düşük viskoziteli ve düşük proteaz mutantlarının elde edildiği saptanmıştır.
kaynak:
https://www.researchgate.net/publication/342454228_Innovative_Techniques_for_Improving_Microbial_Enzyme_Production
yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]