PCR’nin en önemli uygulamaları, DNA’yı çoğaltmak ve miktarını belirlemek veya her ikisini de aynı reaksiyonda yapmaktır. Konvansiyonel PCR’de, tek veya çift DNA molekülü aşağı akım analizleri için yeterli olmadığı için ilgili DNA çoklu kopyalar yapmak üzere amplifiye edilir. Bununla birlikte, geleneksel PCR ile gen ölçümü mümkün değildir, bu nedenle gen ekspresyonu ve DNA ölçümü, geleneksel PCR ile gerçekleştirilemez.
DNA’yı, viral yükü ve patojen miktarını belirlemek için gerçek zamanlı termocycler adı verilen gelişmiş bir PCR makinesine ihtiyaç vardır. Floresan kimyası kullanılarak, bir numunede bulunan DNA miktarı kantitatif PCR ile ölçülebilir. Bir flüoresan boya veya bir hidroliz probu kullanılarak, gen ekspresyonunun gerçek zamanlı PCR’sinin göreli ölçümü, mikroRNA çalışmaları ve patojen yükü ölçümü gerçekleştirilebilir.
Gerçek zamanlı PCR, sitokin ölçümü için altın standart yöntemdir ve hatta tüberkülozu saptamak için en güvenilir kantitatif makinedir. Bununla birlikte, gerçek zamanlı PCR’nin çeşitli sınırlamaları nedeniyle, DNA ölçümü için geliştirilmiş, sağlam ve daha doğru bir yöntem gereklidir. Gerçek zamanlı PCR kullanarak, bilim adamları bir numunede bulunan DNA veya RNA miktarını tahmin edebilirler. Bununla birlikte, reaksiyon hazırlama sırasında kullanılan büyük hacim nedeniyle, istenmeyen nükleik asitlerin miktarının belirlenmesine de yol açabilir. Ek olarak, fazlalık çok büyük olmasa da az miktarda parçacık tanımlanmaz. Bu sorunun üstesinden gelmek için dijital PCR icat edildi. Dijital PCR ilkesi, bir numunenin daha küçük hacimlere bölünerek mutlak miktarının belirlenmesine dayanır. Numuneyi daha küçük bir hacme bölmenin genel fikri, o daha küçük hacimde bulunan tek bir molekülü ölçmek ve böylece ölçümün doğruluğunu arttırmaktır.
İçindekiler
Dijital PCR nedir?
Yaygın olarak dPCR veya dePCR olarak bilinen dijital PCR, gDNA, cDNA veya RNA’nın mutlak ölçümü için kullanılır. 1999’da Bert Vogelstein ve Kenneth Kinzler, kanser mutasyonlarının nadir genotiplerini analiz ederek “dijital PCR”yi keşfettiler. Dijital PCR kavramı, 1992 yılında Sykes ve arkadaşları tarafından tanıtıldı. Yöntem, nadir alelleri tespit etmek ve nokta mutasyonlarını tespit etmek için sıklıkla kullanılır. NGS sırasında klonal amplifikasyon için de kullanılır.
DNA ölçümü için mevcut altın standart yöntem, floresan kimyasına dayalı gerçek zamanlı PCR’dir. DNA ölçümü için hidroliz bazlı bir floresan probu veya DNA bağlantı boyası kullanılır. Kısaca, flüoresan etiketli bir prob, bir numunede sekansa göre bağlandığı tamamlayıcı bir şerit bulduğunda, hidrolize edilmiş prob, makine tarafından algılanan bir flüoresans yayar. Katmanlı boya bazlı yöntemde, floresan boya sadece dsDNA’ya bağlanır ve floresans yayar. Yayılan floresan miktarı cihaz tarafından ölçülür. Ancak, ‘geleneksel qPCR’ uygulaması standartlar gerektirir. Numunenin ölçülmesinde temel olarak standartlar kullanılır, ayrıca numune büyüklüğü aynı olmalıdır.
Ek olarak, nicel bir sınava girmek iki kat daha fazla deneyim gerektirir. Testin rekabetçi doğası nedeniyle multipleks testlerin gerçekleştirilmesi kolay bir iş değildir. Real-time PCR genellikle nadir allelleri veya heterozigot numuneleri tespit etmek için uygulanamaz çünkü iki numune arasındaki kantifikasyon limiti iki yönlüdür. Bu sorunların üstesinden, numuneyi küçük hacimlere bölerek dijital formdaki toplam DNA molekül sayısını sayan, dijital PCR adı verilen yeni nesil bir DNA niceleme yöntemi kullanılarak gelinir. qPCR aynı reaktifleri ve benzer termal döngü koşullarını kullandığından, dijital PCR iş akışı benzerdir. Kimya, tespit için flüoresan moleküllerin kullanımına dayanmaktadır (örn. qPCR). PCR reaksiyonunun hazırlanmasında dNTP’ler, primer seti, PCR solüsyonu, DNA şablonu, Taq DNA polimeraz ve diğer PCR arttırıcılar kullanılır.
Dijital PCR Prensibi
Kantitatif PCR’de, ilk PCR döngüleri üstel değildir, bu nedenle DNA doğru bir şekilde ölçülemez. DPCR’de, PCR reaksiyon karışımının hazırlanmasından sonra, PCR reaksiyon karışımı (şablon DNA ile birlikte), bireysel PCR reaksiyonu bireysel damlacıklarda gerçekleştiği için binlerce küçük damlacığa bölünür.
İşleme modu, floresan (Drop PCR reaksiyonu: dNTP’ler, DNA polimeraz sıcak başlatma, MgCl2, optimize edilmiş reaksiyon tamponu, primerler, floresan probu ve söndürme probu). Her bir mikrogram (damlacık) reaksiyonunda, amplifikasyon miktarı ve DNA moleküllerinin sayısı Poisson dağılım yöntemi kullanılarak ölçüldü. Şablonsuz damlacıktan yayılan floresan “0” olarak adlandırılır ve hesaplama için (negatif PCR reaksiyonu) temel veya sıfır olarak kullanılır. Bir şablona sahip bir damlacıktan salınan floresan miktarı “1” olarak etiketlenir ve tek (pozitif PCR reaksiyonu) olarak kaydedilir.
Hedef DNA’nın mutlak ölçümü, her damlacıkta yapılan pozitif ve negatif etkileşimlerin sayısı kullanılarak Poisson dağıtım yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir. PCR reaksiyonu bölündükten sonra polimeraz uç noktasına hareket eder. Reaksiyon damlacık üreteci, numuneyi 20.000’den fazla nano çöp boyutlu damlacığa böler. Bu nedenle, DNA ölçümü için referans, kalibrasyon eğrisi veya dahili kontrol gerekmez. DPCR’de, reaksiyon karışımı daha küçük mikro hacimli reaksiyonlara bölünür, böylece her bir mikro hacimli reaksiyon için yalnızca bir veya sıfır hedef molekül bulunabilir.
Son hesaplamada, toplam pozitif etkileşim sayısı (bir şablonla), numunenin orijinal hacminde bulunan hedef DNA’nın toplam sayısına eşittir. Mutlak hacim konsantrasyonu şu denklem kullanılarak hesaplanır:
Mutlak konsantrasyon = sayılan toplam şablon sayısı/her damlada ölçülen toplam hacim (veya hazne veya küçük hacimli reaksiyon).
DPCR yöntemi, şablonun tamamlayıcısı olarak bir flüoresan boya probunun kullanıldığı TaqMan kimyasına dayanmaktadır. FAM boyası (floresan boya), HEX raportör boyası ile birlikte kullanılır. bölüm oluşturma yöntemlerinin modelleri; Yağ emülsiyonu, mikrokuyu plakaları, sıvı olmayan gofretler ve kılcal damarlar.
Dijital PCR uygulamaları
Dijital PCR uygulamalarının kullanıldığı birçok alan bulunmaktadır. Bu alanlardan bazıları şunlardır:
• Nadir alellerin yanı sıra nadir dizilerin tespiti.
• Kopya numarasını değiştirmek için doğru çalışmalar
• NGS kitaplığının doğru ölçümü
• Viral yük tespiti
• Patojenlerin tespiti
• Tek bir hücrenin gen ifadesi analizi
• Tanımlanan düşük frekanslı mutasyonları dizileme yaparak doğrulayın.
• Gen ifadesi ve mikroRNA araştırması
DPCR’nin en büyük avantajlarından biri, dijital PCR’nin gen ekspresyonundaki %30’dan daha az farkı tespit edebilmesi ve sadece bir kopya sayısı farkının doğru bir şekilde ayırt edilebilmesidir. Ek olarak, alelik frekansları %0,1’den az olan alelleri tanımlayabilir.
Dijital PCR’nin Avantajları
• Basit kurulum, kantitatif PCR’de olduğu gibi daha yüksek uzmanlık gerektirmez.
• Daha yüksek hassasiyet
• Yüksek tekrar
• Düşük numunelerde hedef ölçümü
• Geliştirilmiş çarpan yeteneği
• PCR inhibitörlerine karşı yüksek tolerans
• Düşük frekanslı genotiplerin erken ve doğru tespiti.
Dijital PCR damlacığı
Yağ-su emülsiyon teknolojisi sürecinde, ayırma reaksiyonu için nano boyutlu bir yağ damlacığı oluşur. Bu teknik kullanılarak DNA miktarının belirlenmesi damlacık dijital PCR olarak adlandırılır. Bununla birlikte, dijital damlacık PCR’nin temel prensibi dPCR’ye benzer. DdPCR, mutlak ölçüm için 20.000’den fazla mikrogram segment verir. Reaksiyon bölünürse, daha küçük hacimli reaksiyonlar, küçük hacimli reaksiyon odasında sıfır veya bir kalıp olma şansı o kadar yüksek olur, bu nedenle sayım daha doğru olur. Bu nedenle, nadir alel tespiti ve düşük frekanslı genotip tespiti için ddPCR (yağ-su emülsiyon tekniği kullanılarak) önerilir.
PCR, DNA ölçümü için kullanılan en doğru yöntemlerden biridir. Tek bir aleli bile saptama yeteneği, kanser araştırmalarında ve kanser geliştirmede nadir görülen mutasyonların ve nadir alellerin saptanmasında daha yüksek doğrulukta sonuçlar sağlar.
kaynak:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26843045
https://www.gen-era.com.tr/digital-pcr
http://www.journalagent.com/turkhijyen/pdfs/THDBD-48902-REVIEW-CARHAN.pdf
yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]