Günümüzde ilaç ve biyoteknoloji sektöründe; Hücreleri biyofaktör olarak kullanarak, ilgili genleri dışarıdan hücrelere aktararak, büyüme faktörleri, insan insülin hormonları ve antikorları gibi hastalık tedavisinde kullanılan proteinler, geleneksel yöntemlere göre daha yüksek verimlilikle üretilebilir. Örneğin dünyanın dört bir yanındaki diyabetli insanlar, insan insülin genini tütün bitkisine aktararak tütün bitkisinden büyük miktarlarda üretilebilen insan insülin hormonunu kullanırlar. Bu yöntem geliştirilmeden önce şeker hastaları, domuz pankreasından elde edilen ve insanlarda alerjik reaksiyonlara neden olan daha pahalı olan insülin hormonunu kullanıyorlardı. Genetik mühendisliği yöntemleri son yıllarda nasıl bu kadar sık kullanılıyor ve hücreler bu proteinleri üretmek için nasıl tasarlanıyor?
Protein üretiminde belirleyici adım, gerekli proteini toplu ve çözünür halde üretebilen bir yapı oluşturmaktır. Bu süreçte, protein kodlayan gen, plazmit adı verilen DNA’nın dairesel bir bölümünün yapısına eklenir (kopyalanır) ve plazmit, geni hücreye aktarmak için bir ara madde (taşıyıcı) görevi görür. Bazen genleri protein üretimi için bir ara ürüne klonlamak mümkün olsa da, özellikle insan proteinleri için fonksiyonel ifadeye sahip gen klonlarının verimli üretimi ciddi bir darboğaz oluşturur. Protein üretimi genellikle zor, karmaşık ve çok adımlı bir süreçtir. Çünkü genden protein üretiminde bir hata olabilir ya da protein çözünmeyen aglomeralar halinde sentezlenebilir ve standart yöntemlerle saflaştırılamaz. Çoğu durumda, araştırmacılar klonlama aşamasına geri döner ve ya klonlanacak genin yeni bir parçasını oluşturur ya da yeni bir saflaştırma yöntemi kullanır ya da proteini farklı bir konakçı hücrede üretir. Bu genellikle yeni bir klonlama deneyinin oluşturulmasını gerektirir ve sekans analizini içeren çok adımlı bir süreçtir. Arayanların çoğu bir kopya oluşturur, dener ve bir şeyler ters giderse, yeniden başlatılır ve baştan başlar. Bu nedenle protein üretimi çok pahalı ve zaman alıcıdır.
Rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesiyle birlikte protein üretim yöntemleri de değişti. Bu aşamadan sonra hücreye düşük maliyetle birden fazla gen aktarılabilir ve sistem manipüle edilebilir. Birçok rekombinasyon klonlama sistemi mevcut olsa da, sözde Ağ Geçidi sistemi en büyük esnekliği gösterir. Bu sistem protein üretimi için hızlı ve kalıcıdır.
Kapı sistemi, çeşitli konak hücreler için kullanılabilen bir protein üretim yöntemidir. Bu sistemin avantajı, tek bir gen yerine birden fazla genden aynı anda protein üretilebilmesidir. Bu da yöntemin başarı oranını arttırır. Ayrıca bu yöntemde deneysel çalışmalar için de endüstriyel ölçekte büyük miktarlarda protein üretilmesi mümkündür.
Portal sistem Çok aşamalı bir klonlama yöntemi olup, vektörler arasında gen aktarımı yapılırken klasik restriksiyon enzimi klivajı (DNA’yı kesen bir enzim) ve ligaz enzimleri (DNA parçalarını birbirine bağlayan bir enzim türü) gerekmemektedir. Bu şekilde klonlamanın bir avantajı, rekombinasyon (iki DNA parçasının değişimi) yoluyla genlerin birden fazla vektöre aktarılabilmesidir. Gate yönteminde iki tip klon kullanılmaktadır. Bunlardan biri; Giriş klonları nispeten sessizdir ve dizileri bilinmektedir. İfade klonu, proteinin üretileceği ve giriş klonuyla yeniden birleştirileceği yapıdır. Rekombinasyon, vektör ile üzerindeki siteler arasında gerçekleşir. Bu bölgelerin dört tipi vardır. bunlar; Bunlar attP, attB, attL ve attR’dir. Giriş transkriptleri attL bölgelerini içerirken, ifade transkriptleri attB bölgelerini içerir.
İstenen proteini üretecek gen, çeşitli yollarla Giriş klonu adı verilen bir ara ürüne aktarılabilir. Klonlama stratejisindeki esnekliği artırmak için, genleri giriş klonlarına aktarmak için bir kapı rekombinasyon reaksiyonu kullanılabilir. Giriş klonu üretilip dizildikten sonra, ilgili geni Giriş klonundan nihai ifade klonuna aktarmak için ikinci bir rekombinasyon reaksiyonu kullanılır. Bu transfer için kullanılan vektöre hedef vektör denir. Hedef vektör, protein üretimi için gerekli olan tüm DNA dizilerini taşır. Bu dizi; Promotör (enzimin genden protein üretimine bağlandığı dizi), antibiyotik direnç geni ve plazmid replikasyonunun kökenleri. İstenen geni içeren fragman portal kaseti içerir. Bu bölge, kloramfenikole ve ccdB adı verilen bir toksine karşı direnç genini içerir. Bu genlerin yanı sıra ATR rekombinasyon bölgeleri de vardır. Kasetin tamamı bir rekombinasyon reaksiyonu ile yer değiştirir. Bu etkileşimden sonra, nihai ekspresyon klonu (genin proteini ürettiği vektör), giriş klonuna eklenen tüm hedef vektörü ve kapı kasetini içerir. Hedef vektördeki antibiyotik direnç genleri, antibiyotik varlığında tedavi sırasında gen aktarılamadığından, hücre popülasyonundaki hücrelerin taranmasını sağlar. Böylece sadece genin aktarıldığı bir hücre grubu elde edilir. Bu, yüksek verimlilikle ekspresyon klonlarının üretilmesine izin verir.
Genetik mühendisliği yöntemlerinin gelişmesi ile gelecekte sağlıkta veya diğer alanlarda ihtiyaç duyulan tüm proteinlerin daha düşük maliyetle ve daha yüksek miktarlarda üretilmesi mümkün olabilecektir.
Kaynak:
a. Doyle. Yüksek verimli protein saflaştırması ve ifadesi
yazar: Ayka Olkay
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]