DNA; Dört farklı nükleotitten oluşur: adenin, guanin, sitozin ve timin. Bu nükleotitlerin farklı kombinasyonlara dizilmesiyle bir DNA dizisi oluşturulur. DNA üzerindeki genler de birbirinden farklı dizilimlere sahiptir ve dolayısıyla farklı işlevler gösterirler. Organizmaların genom dizilimini (DNA’daki genler ve diğer dizilerle birlikte) bilmek, hem organizmaların doğasını hem de genetik hastalıkların mekanizmasını anlamak açısından çok önemlidir.
DNA’nın çok uzun bir molekül olduğu göz önüne alındığında, DNA dizilemesi ileri teknoloji gerektiren oldukça zorlu bir süreçtir. Bu nedenle teknolojik gelişmelerle birlikte gelişmesi yıllar almıştır.
DNA dizileme ile ilgili ilk çalışmalardan biri Fred Sanger tarafından yapılmıştır. Fred Sanger, bilimsel hayatını dizileri tanımlamaya adadı. DNA’dan önce bazı protein ve RNA molekülleri dizilmişti.
Dizideki ilk protein insülindir. Sekans, 1950’lerde Sanger tarafından ortaya çıkarıldı. İnsülin dizisini belirlemenin ilk adımında iki insülin zincirini birbirinden ayırdı. Bu parçaları sıraladı, düzenlediği parçaları karşılaştırdı ve parçaların nerede örtüştüğünü buldu. Çalışmasının bir sonucu olarak, proteinlerin amino asitlerden oluştuğunu kesin olarak kanıtladı. Protein dizilemesini Edman hidrolizinden (peptit zincirinin nitrojen ucunun tekrar tekrar çıkarılması) daha kolay hale getirdi. Bu yöntemler biraz zahmetli olsa da, 1960’ların sonlarında çok sayıda protein dizilendi ve protein dizilerinin türler ve bireyler arasında değiştiği bulundu.
1960’ların başında, RNA dizilemesi benzer bir şekilde gerçekleştirildi. RNA, RNAaz enzimleri tarafından parçalanır. Fragmanlar kromatografi ve elektroforez ile ayrıldı. Her bir fragmana ekzoklaz (molekülünü çekirdeğinden kesen bir enzim) uygulanmış ve fragmanların üst üste binen noktaları bulunarak dizi ortaya çıkarılmıştır. Tespit edilen ilk RNA sekansı, amino asit alanin için bir taşıyıcı RNA idi. Bunun için 5 kişi 1 gram saf madde (140 kg mayadan izole edilmiş) üzerinde 3 yıl çalıştı. Bu şekilde 76 nükleotit tanımlandı. Bu işlem parmak izi teknolojisi ile basitleştirilmiştir. Bu teknikte, radyoaktif olarak işaretlenmiş RNA fragmanları ayrılır ve iki boyutlu olarak görüntülenir. Böylece boyutu ve dizisi belirlenir.
DNA dizisini keşfedin
DNA dizilimine yönelik ilk girişimler zahmetliydi. 1968’de Wu adlı bir araştırmacı, lambda sporlarının (bakterileri enfekte eden bir virüs türü) DNA’sının sonundaki 12 baz olan primerleri (kısa DNA dizileri) genişletme yöntemini tanımladı. 1973’te Gilbert ve Maxam, DNA’daki laktoz inhibitörü bağlanma bölgesini tanımladı. Bunu yaparken, dizi RNA’ya çevrildi ve fragmanlar düzenlendi. Bu süreç iki ay sürdü. Bazılarını bulmak bir ay sürdü.
1976 civarındaki gelişmelerin bir sonucu olarak, iki yöntem bir gecede yüzlerce seri haline getirildi. Bu iki yöntem Sanger ve Coulson tarafından geliştirilen seri üretim yöntemi ve Maxam ve Gilbert tarafından geliştirilen kimyasal parçalama yöntemidir. Sanger yönteminde sentez, dideoksi grupları ve diğer nükleotitlerin eklendiği bir nükleotit karışımı ile bir DNA şablonundan yapılır.
Sentez, bir dedeoksinükleotidin eklendiği noktada sona erer. Bu sayede farklı boylarda parçalar elde edilir. Her segmentin sonunda farklı bir deoksinükleotid bulunur. Buna göre dizi elektroforezde kesitler ayrıldıktan sonra elde edilir. Sanger yönteminden farklı olarak, Maxam ve Gilbert’in yöntemi DNA sentezinden çok DNA kesmeye dayanır. DNA’daki bazlar radyofosfatlarla etiketlenir ve DNA, radyofosfatların parçalarından parçalanır. Her iki yöntemde de fragmanlar jel elektroforezi ile ayrılır. Jellerdeki her sütun bir baza karşılık gelir. Jel, röntgen filmi üzerine yerleştirilir. Sekans, filmde bulunan radyasyonlara göre çıkarılır.
Bu yöntemler, silah dizisinin geliştirilmesiyle hızlandı. Av tüfeği sıralaması, rastgele DNA parçalarını sıralamaya ve ardından parçalarda hangi parçaların örtüştüğüne göre sıralamaya dayanır. Bu yöntem, 1979’da Staden tarafından önerildi. Hücre dışı DNA fragmanları, tek sarmallı M13 klon fajları geliştirilerek birleştirildi. 1987’de, otomatik floresan türevli Sanger dizileme makineleri, Smith ve Hood ve Applied Biosystem tarafından geliştirildi. Bu makineler günde yaklaşık 1.000 bazı dizileme yeteneğine sahiptir. Sekanslanan genom sayısının artması ile birlikte verilerin saklanabileceği veritabanlarının (GenBank, BLAST) geliştirilmesi gerekli hale gelmiştir. 1982’ye gelindiğinde, GenBank’ta yarım milyondan fazla baz saklanıyordu. 1986’da bu sayı 10 milyona ulaştı.
İnsan genom dizisi
Av tüfeği stratejisi İnsan Genomu Projesinde kullanılmıştır. İnsan genomunun büyük parçaları, bakteriyel sentetik kromozomlara (BAC) aktarılarak büyütüldü (klonlandı). Her BAC’deki DNA parçalandı, boyutu seçildi ve yeniden örneklendi. Yapay kromozomların aktarıldığı hücreler çoğaltıldı ve DNA izole edildi. Saflaştırılmış DNA, otomatik Sanger sıralaması için şablon olarak kullanıldı. Dizileme sırasında nükleotidlerdeki bazlar sinyal verir ve sinyaller jelin lazerle taranmasıyla elde edilir. Bu süreç birkaç bağımsız adımı içerir. Yöntemin başarısı için bu adımların hepsinin etkili olması önemlidir.
Daha büyük genom dizileri üzerinde çalışıldıkça her adımın verimliliği arttı. Bu, 1990’larda gerçekleştirilen girişimlerle mümkün olmuştur. Bu yıllardaki önemli gelişmeler: 1) Kısa, boyalı diziler yerine kromozomal olarak etiketlenmiş uçlar (DNA dizilerinin uçları) kullanılarak, aynı anda bir yerine dört zincirli reaksiyon meydana gelebilir. 2) Lineer amplifikasyon (DNA amplifikasyon) reaksiyonları, bir DNA şablonuna olan ihtiyacı azaltmıştır. 3) Basitçe ön dizileme adımlarını otomatikleştiren manyetik boncuk bazlı DNA saflaştırma reaksiyonları. 4) Kılcal elektroforezin gelişmesiyle birlikte, jel döküm ve yükleme işlemlerine gerek kalmaz, bu da nükleotitlerden floresan sinyalinin çıkarılmasını ve yorumlanmasını kolaylaştırır. 5) Endüstriyel süreçler maksimum verimlilik ve minimum hataya odaklanır (örn. otomasyon, kalite kontrol, standart işletim prosedürleri, vb.).
DNA dizilemesinden önceki adımlar zorluğun yarısıdır. kaydadeğer çaba Klonları izlemek ve sıralama verilerini yorumlamak ve birleştirmek için geliştirilen yazılımlara odaklanır. Bir DNA dizisinin çıkarılması, özellikle dizi çok uzun olduğunda, bir insanın kendi başına çıkarması için sıkıcı ve zaman alıcı bir süreçtir. Yani teknolojinin gelişmesiyle birlikte bilgisayarlar devreye girmiştir. örnek; Dizi okumalarının manuel olarak düzenlenmesinin yerini phred (sinyal kalitesini bir tabandan ölçen ve onu yakından tekrarlanan dizilerden ayırmaya çalışan bir yöntem) gibi yöntemler almıştır. Her okuma, örtüşmelerle (parçaların ortak parçaları) birleştirilir ve uzun bir dizi elde edilir. Daha karmaşık bir genomdaki çok sayıda tekrarlayan dizi, süreci daha da kafa karıştırıcı hale getirir. BAC silah sekansında bile bazı sekanslar gösterilmedi.
Süreç ana hatlarıyla oturmuş gibi görünse de, dizileme teknolojilerindeki gerçek ilerlemeler 1990’larda bilgisayar biliminin gelişmesiyle mümkün olmuştur. 2001 yılına kadar, birkaç akademik genomik merkezi, otomatik üretim yoluyla günde 10 milyona kadar baz üretebiliyordu. Genom birleştirme programı (phrap, TIGR ve Celera birleştirici), İnsan Genom Projesi içinde ve dışında olgunlaştı. İnsan Genom Projesi kapsamında dizilenen insan genomu, C. elegans’ınkinden 30 kat daha büyük ve daha fazla tekrar eden dizi içeriyor. Bu seri 2004 yılında tamamlandı. 2004 yılına kadar sıralayıcılar, 600-700 baz çifti için 1 ABD Doları maliyetle seri üretildi.
1980’lerde ve 1990’larda araştırmacılar elektroforeze dayalı sıralamaya alternatifler aradılar. İnsan Genomu Projesi’nin sonuna kadar bu çabalar sonuç vermese de, yeni nesil DNA dizileme (NGS), Sanger dizilemenin yerini neredeyse tamamen aldı. NGS teknikleri, birkaç yönden Sanger dizilemesinden keskin bir şekilde farklıdır. Ancak kilit nokta, NGS’nin çoklu yöntem olmasıdır. Tüp başına bir reaksiyon yerine, DNA şablonunun tüm parçaları 2 boyutlu bir yüzey üzerine yoğun bir şekilde bindirilir. Bakteriyel klonlar yerine, dizilenen her şablon, in vitro amplifikasyon ile amplifiye edilir. Bu şekilde, DNA’nın farklı bölümleri aynı anda kopyalanır ve sıralanır.
2005 yılında 454, ilk ticari NGS cihazı olarak ortaya çıktı. İnsan Genom Projesi’nde uygulanan dizileme yöntemleri birçok genom merkezine kaynak olmuştur. 454 ve diğer rakip cihazlar izledi. Böylece özel laboratuvarlar da genom dizileme altyapısına kavuşmuş oldu.
İnsan Genom Projesi Sırasında; NGS için Roche, Illumina, Applied Biosystems, Helicos, Complete Genomics ve Ion Torrent arasında sıkı bir rekabet var. Bu rekabet sonucunda 2007-2012 yılları arasında baz başına DNA dizileme fiyatında hızlı bir düşüş yaşandı.
2012’den itibaren ilerleme hızı ve şirketler arasındaki rekabet zayıfladı. Platformlar 454, SOLiD ve Helicos artık geliştirme aşamasında değil. Bunun yerine Illumina platformu baskın hale geldi. Buna rağmen, 2005 yılından bu yana NGS teknolojisinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. NGS teknolojisi ile DNA okuma dizileri %99,9’un üzerinde doğrulukla elde edilebilmektedir. Son olarak, tek bir makine (Illumina NovaSeq) ile iki günde ve birkaç bin dolar maliyetle bir milyar DNA baz okuması yapılabilir. Dizileme teknolojisi gelişmesine rağmen, bu alanda çalışmalar devam etmektedir. Bu aşamadan sonra çalışılan konular; Metilasyon gibi DNA’daki değişikliklerin tek molekül dizilimi ve haritalanması.
Kaynak:
1) Şendure ve Ark. 40’ta DNA dizilimi: geçmiş ve şimdiki zaman /
Ve gelecek. doi: 10.1038/nature24286.
yazar: Ayka Olkay
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]