Birçok tıbbi uygulama ve bilimsel çalışma için, belirli bir hücre tipini kan veya diğer numunelerdeki karışık bir hücre grubundan ayırmaya ve taramaya ihtiyaç vardır. örnek; Hastalığı teşhis etmek için sadece lenfosit adı verilen kan hücrelerini kanınızdan ayırmanız ve incelemeniz yeterli olabilir. Bunu yapmak için akış sitometresi adı verilen bir cihaz kullanılır.
Tarihsel olarak, geliştirilen ilk akış sitometrisi, hücrelerin boyutunu saptayabilir. Günümüzde bu cihazlar çok gelişmiş olup aynı anda 14 parametreyi algılama yeteneğine sahiptir. akış sitometrisi; Bir ışık kaynağının önünden geçerken tek bir hücrenin veya mikroorganizmalar, çekirdekler ve kromozomlar gibi diğer moleküllerin optik ve radyometrik özelliklerini algılayabilir. Böylece, antikorların veya boyaların boyutu ve radyasyon özellikleri gibi parametreler, hücreleri birbirinden analiz etmek ve ayırt etmek için kullanılır. Akış sitometrisinin arkasındaki ilke. Işığın saçılması ve ışığın kaynaktan çıktıktan sonra hareket eden bir parçacığa çarpmasından sonra ortaya çıkan ışık olan radyasyon emisyonu ile ilgilidir. Elde edilen veriler partiküllerin biyokimyasal, biyofiziksel ve moleküler yönleri hakkında önemli bilgiler verebilmektedir. Floresan bir probdan elde edilen radyasyonun emisyonu, hücreye ve hücresel bileşenlere bağlanabilen floresan prob miktarı ile orantılıyken, ışık saçılması hücrenin yapısal ve morfolojik özellikleri ile ilgilidir.
Diferansiyel ve ayrımcı olmayan iki tür akış sitometrisi vardır. Ayırıcı tip, parçacıkları ayırabilirken, ayırıcı olmayan tip, ışık saçılımı ve radyasyon emisyonu özelliklerine sahiptir. Floresan hücre ayırıcılar (FACS), floresan etiketli hücreleri karışık bir hücre popülasyonundan ayırabilen akış sitometreleridir.
Akış sitometrelerinin ve hücre sınıflandırma cihazlarının ana bileşenleri; Akışkanlar, optikler, elektronik ağlar (dedektörler) ve bilgisayarlar. sıvılar. Sıvı parçacıkların odaklanmış ışık kaynağına doğru yönlendirilmesinden sorumludur. Grup optiği, saçılma veya flüoresan ışığı parçacıktan bir elektron kafesine iletirken, uyarma optiği ışık kaynağını hücrelere veya parçacıklara odaklar. Elektronik ağ sinyali tanımlar ve dijital veriye dönüştürür. Sayısal veriler, ışığın şiddeti ile orantılıdır ve verileri analiz etmek için bir bilgisayar da gereklidir.
akış sitometrisi; Hücre zarı, sitoplazma ve çekirdekte bulunan proteinlerin tanımlanmasına dayalı çeşitli uygulamalarda kullanılabilir. Ayrıca tüm hücreler, organeller, çekirdekler, DNA, RNA, kromozomlar, sitokinler, hormonlar ve protein içeriği gibi hücresel bileşenler akış sitometrisi ile tespit edilebilir. Hücre proliferasyonu ve hücre döngüsünün analizi, kalsiyum akışının ölçümü ve membran potansiyeli, akış sitometrisi için geliştirilen yöntemlerin en yaygın örneklerinden bazılarıdır.
akış sitometrisinin bileşenleri
sıvı sistemi
Akışkan sistemi, çevredeki akışkan ve basınç alanı hakkında veri elde etmek için hücreleri solüsyondan cihaza aktarır. Sıvı ortam (genellikle PBS) seyreltici bir sıvıdır. Bu sıvı, basınçlı alanın ortasındaki akış odasına enjekte edilir. Ek olarak basınçlı hava, numune tüpünden sarkan hücreleri akış odasına enjekte eder. Hücre enjeksiyon hızı, analiz amacıyla manipüle edilebilir. örnek; Daha yüksek akım oranı, memeli hücrelerinin profillenmesi gibi niteliksel ölçümler için kullanılır. Düşük akış hızı, DNA içerik analizi için uygundur. Analizin doğru şekilde yapılabilmesi için sıvı sisteminde hava kabarcığı bulunmamalıdır.
sistem optiği
akış sitometrisi; Kolokasyon optikleri, lazerler ve lensler dahil olmak üzere ışık saçılımını sabit bir konumda tutan bir optik sisteme sahiptir. Lensler, lazer ışığını odaklamak için kullanılır. Lazer hücreye çarptıktan sonra hücrenin kenarlarından saçılır ve buna ışık saçılması denir. İki tür saçılma vardır: ileri saçılma (FCS) ve yan saçılma (SSC). toplam ışık saçılımını etkileyen faktörler; Zar, çekirdek, hücre tanecikliği, şekil ve yüzey özellikleri. Genel olarak hücrenin şekli ve hücrenin iç yapısının karmaşıklığı dağılımın türünü belirler. FCS, hücre boyutunu tanımlar. SSC, hücreden yansıyan ışıktır ve hücrenin iç yapısının karmaşıklığı ile orantılıdır. Heterojen bir hücre popülasyonu içindeki hücre tiplerini ayırt etmek için FCS ve SSC ölçümleri birlikte kullanılmalıdır.
Akış sitometrisinde, florokrom tipine bağlı olarak birkaç lazer konfigürasyonu vardır. Argon lazer, FITC gibi sentetik boyaları ve alglerden elde edilen doğal boyaları uyarmak için yaygın olarak kullanılır.
Optik montaj parçası ışığı toplar ve doğrudan dedektöre iletir. Uygun bir filtre kullanılarak, boyanın flüoresan özelliği dedektör tarafından belirlenebilir. Elde edilen veriler bilgisayarda grafik olarak gösterilebilir.
Elektrostatik hücre ayırma
Akış sitometrisinde, hücreler yakalanır ve önceden belirlenmiş özelliklere göre sıralanır. ilgilenilen hücre türü toplandığında; Mikroskobik, biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmalar gibi ileri analizler için kullanılabilir. Hücreleri ayırmak için tek bir parametre veya birçok parametrenin bir kombinasyonu kullanılabilir. hücre ayrımının genel prensibi; Yüklü parçacıklar içeren hücrelerin elektrostatik sapmasına dayanır. Bu yöntemde sıvıdaki damlacıklar lazer kaynağının önünden geçerken elektrotlar tarafından yüklenir. Damlacıklar, yüklerine göre ana akımdan sapar. Pozitif yüklü damlacıklar, negatif yüklü platin kısma doğru sapar ve negatif yüklü damlacıklar, pozitif yüklü platin kısma doğru sapar. Boş damlalar da atık bölümünde toplanır.
FACS; Bir veya daha fazla spesifik floresan etiketli hücre tipini karışık bir hücre popülasyonundan ayırt edebilen bir tür akış sitometrisi. Sıvı lazer kaynağının önüne geçtiğinde; Bilgisayar destekli tanımlama için ayrı floresan etiketli hücreler. Floresan etiketli hücreler damlacığa yüklenir ve yüklenen hücre tipleri farklı bölümlere ayrılır.
radyasyon prensibi
Bir flüoresan armatür, ışık enerjisini emen belirli dalga boylarına sahiptir. Işığın soğurulması, bir elektronun temel halden daha yüksek bir enerji seviyesine geçmesine neden olur. Uyarılan elektron, fazla enerjiyi bir ışık fotonu olarak serbest bırakırken hızla temel duruma geri döner. Bu enerji transferine floresan denir. Akış sitometrisi ayrıca hücreleri tespit etmek için floresan kullanır.
Florokrom ve özellikleri
Hücrelerdeki floresan bileşenlerin sayısı sınırlıdır. Bu nedenle hücreler, florokrom adı verilen floresan problarla etiketlenir. Farklı hücre popülasyonlarının floresan probları, hücre reseptörlerinin ve organellerinin tanımlanması, hücre ayrımı, immünofenotipleme, DNA içeriğinin belirlenmesi, enzim aktivitesinin ölçülmesi ve apoptotik hücre sayısının belirlenmesi gibi birçok uygulamada kullanılmaktadır.
akış sitometrisinde kullanılan florokromlar; Birkaç gruba ayrılırlar: proteinleri etiketlemek için kullanılan florokromlar, nükleik asitler için florokromlar ve haberci moleküller. Doğru florokromu seçmek önemlidir ve kullanılacak lazere bağlıdır. örnek; Bir argon iyon lazeri kullanılacaksa, ilk tercih FITCH florokromdur.
veri analizi
Akış sitometri verilerinin analizi, biyolojik deneyler için en önemli parametredir. Veri analizinde en önemli ilke, incelenmekte olan hücre tipini ve özelliklerini görselleştirmektir. Bilgisayarda görüntülenen grafikte birkaç bölge seçilebilir. Bu parametreler, sonuçların ölü hücreler gibi istenmeyen parçacıklardan çıkarılmasına izin verir. Beyaz kan hücreleri, granülositler, monositler ve lenfositlerin farklı özellikleri bu şekilde birbirinden ayırt edilebilir. Bir araştırmacı yalnızca lenfositleri analiz etmek istediğinde, lenfositler, FSC veya hücre boyutuna dayalı olarak SSC’ye karşı FSC kullanılarak analiz edilebilir. Elde edilen sonuç sadece lenfositlerin floresan özelliklerini gösterir. Bu sayede istenilen hücre tipi diğer hücrelerden ayrılmış olur. Ayrılan hücreler, mutasyon analizi gibi ileri analizler için de kullanılabilir.
Kaynak:
1) Aden ve Ark. Akış sitometrisi: temel prensipler ve uygulamalar. Crit Rev Biotechnol, Erken Çevrimiçi: 1–14.
yazar: Ayka Olkay
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]