Bir gende mutasyonların oluşturulduğu yöntemler, bir genin işlevini incelemek için kullanılır. Bunun için mutajenik (dönüştürücü) kimyasalların kullanımı pahalıdır ve gen fonksiyonunun geniş ölçekli çalışmasına izin vermez. Bu nedenle, mutasyonlar oluşturmak için genom içine yerleştirilebilen transpozonların kullanılması daha uygundur. Transpozonların kendileri genomun içine girebilir ve bir belirteç görevi görebilir. Bu şekilde transpozonların genomdaki yeri ve gen fonksiyonu üzerindeki etkileri değerlendirilebilir. Bununla birlikte, transpozonun memelilerde kullanımı, etkili bir transpozon sisteminin olmaması nedeniyle sınırlıdır.
transpozon mekanizması
Bir DNA parçası orijinal konumundan kopyalanabilir, kesilebilir ve dairesel hale geldikten sonra DNA’nın başka bir yerine yerleştirilebilir ve orada işlevini sürdürebilir. Bu işleme translokasyon, transpozon sürecinden geçen DNA parçasına da transpozon denir. Transpozonlar, işlevsel bir gene yerleştirilebilir. Bu olay sıklıkla mutasyona neden olur ve gen fonksiyonunu bozar.
Genomda transpozonları kodlayan genler vardır. transferler. Etki mekanizmalarının farklılığından dolayı ters transpozonlar ve DNA transpozonları olarak ikiye ayrılırlar. Retrotranspozonlar kendilerini RNA’ya kopyalar ve RNA tekrar DNA’ya çevrilir. DNA’nın kopyası kendisini genomda yeni bir konuma yerleştirir. Bu işlem bir kopyala yapıştır mekanizmasıdır. DNA transpozonları kes-yapıştır mekanizmasıyla çalışır. Bulundukları yerden izole edilirler ve genomda başka bir yere yerleşirler. DNA transpozonları, yeni gen araştırmaları ve gen fonksiyon belirleme çalışmaları için önemlidir.
Transpozonlar, bir hücrenin kromozomlarına gen yerleştirmek veya bir genin kodunu çözerek işlevini anlamak için kullanılabilir. Transpozonlar, transposaz adı verilen enzimler tarafından birbirinden ayrılır. Bu nedenle genetik mühendisliği yöntemlerinde transpozonlar kullanılırken, transpozaz enzimi başka bir transpozazda (gen aktarımı için kullanılan araç) bulunur. Ek olarak, transpozonların özelliği, transpozaz enziminin dizisinin genetik mühendisliği ile ayrılmasıdır. Transposaz, yalnızca bir DNA transposaz fragmanının varlığında çalışabilir. Bu sistem ikili dönüştürme sistemi olarak adlandırılır ve aktarımın güvenliğini artırır.
PiggyBAC (PB) Transpozon Avantajları
Memelilerde, taşımanın kullanımı, verimli bir taşıma sisteminin olmaması nedeniyle sınırlandırılmıştır. Memelilerde kullanılan transpozon sistemleri şunlardır: 1) Zebra balığından izole edilen başlık benzeri Tol2, 2) Kurbağa ve balık genomuna transpozonlar inşa edilerek oluşturulan Tcl benzeri (SB) transpozonlar ve 3) timsahlardan PB. Bu transdüksiyon sistemleri arasında memeli hücrelerinde en yüksek aktiviteyi SB ve PB göstermiştir. PB; Memeliler, böcekler ve maya gibi çok sayıda organizma üzerinde etkili olmalarının yanı sıra, laboratuvarda da üretilebilirler. SB transpozonun PB transpozondan ayrıldığı nokta, genomda eser miktarda CAG (DNA’da sitozin, adenin ve nükleotidler) bırakmasıdır. Bu mod, SB kullanımını kısıtlar. PB, SB’den daha yüksek transpozon aktivitesine sahiptir. PB iz bırakmadığı ve dolayısıyla genoma zarar vermediği için tercih edilir.
PB öğesinin uzunluğu 2,4 KB’dir. Gen, PB’deki tekrarlayan diziler arasına yerleştirilebilir. Ayrı bir vektörde bulunan bir transpozaz enzimi de bunu yapabilir. Bu şekilde gen, genomun TTAA (timin, adenin ve adenin nükleotit dizisi) segmentinin bulunduğu bölgesinde yer alabilir.
PB bir kes-yapıştır transpozonudur. PB elementi donör DNA’sından bir transpozaz enzimi yardımıyla kesilir ve genoma eklenir. Boşluğun DNA sentezi PB’nin ayrıldığı kısımda gerçekleşmez ve boşluk bir DNA ligaz enzimi yardımıyla kapatılır.
PB, diğer vektörlerden farklı bazı özelliklere sahiptir. Virüs vektörlerinden daha güvenlidirler. Diğer transpozonlara kıyasla daha büyük DNA fragmanları (9.1–14.3 kb) taşıyabilir. Ayrıca dönüştürme kabiliyetinin yüksek olması ve iz bırakmaması onları daha pratik bir araç haline getirir. PB avantajları; Yüksek verimli transdüksiyon, uzun dizi taşıma, uzun süreli stabil ekspresyon, tek bir kopya halinde genom içine bir genin eklenmesi, hedef genin in vivo izlenmesi ve genomda hangi bölgeye girdiğinin kolayca saptanması.
PB, bir hedef hücrenin genomuna entegre olabildiğinden ve uzun süreli gen aktivitesi sağlayabildiğinden, gen terapisi uygulamaları için uygun bir araçtır. Ayrıca diğer viral vektör sistemlerine göre avantajları vardır. Elektroporasyon ile hücre içine aktarılabilirler. Ayrıca herhangi bir viral vektörün taşıdığı viral antijenleri taşımadıkları için bağışıklık sistemi tepkisine neden olmazlar. Bu özellikler, klinik uygulamalar için kullanımlarını kolaylaştırır ve daha az maliyetlidir. Uzunluğu 14.000 baza kadar olan DNA dizilerini taşıyabilir. Böylece, bu sistem kullanılarak önemli terapötik genlerin aktarılması mümkün olabilir. Ayrıca viral vektörlere göre üretilmesi daha kolaydır.
14.000 baza kadar uzunluğa sahip genomik bölgeleri taşıyabilir, ancak transkribe edilecek bölgenin artan boyutuyla dönüşüm etkinliği azalır. Böylece viral vektörlerin taşıyamadığı büyük DNA parçalarını taşıyabilirler.
Viral vektörler ayrıca, hastalıkların tedavisinde kullanılmak üzere hastalardan alınan deri hücrelerini iPS hücrelerine dönüştürmek için kullanılmıştır. Bunun için gen seti viral vektörler aracılığıyla deri hücrelerine aktarıldı ve hücre pluripotent kök hücreye dönüştürüldü.Son araştırmalar, bu gen setinin PB kullanılarak aktarılmasının daha etkili, yan etkisi olmayan ve daha ucuz olduğunu göstermiştir. . Böylece PB, gen terapisi alanında yeni bir çağ başlattı. İlerleyen yıllarda PB sisteminin kullanıldığı klinik denemeler sonrasında bu sistemin birçok hastalığın tedavisinde kullanıldığını görebiliriz.
Kaynak:
1) Yemek gevreği. PiggyBac transpozon vektörleri: insan geni kodlama araçları. Lung Cancer Res 2016 tarafından çevrilmiştir; 5 (1): 120-125
2) Domuzcuk. Mobil genetik elemanlar, genetik protokoller ve uygulamalar.
yazar: Ayka Olkay
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]