Gen nakavt Bir geni çıkararak ve bir hücre veya organizma üzerindeki etkilerini gözlemleyerek genlerin işlevini incelemek için kullanılan bir moleküler biyoloji yöntemidir. Bu, geni tamamen silerek, gende mutasyonlar getirerek, gen ekspresyonunu baskılayarak veya geni olgun organizmada düzenleyerek elde edilebilir.
Genetik nakavt yöntemleri
Sentetik gen çoğaltma organizmasını oluşturmak için, ilgili geni susturmak veya çıkarmak için çeşitli yöntemler kullanılır. Genetik nakavt yöntemleri şunları içerir:
gen susturma
koşullu nakavt
Homolog rekombinasyon
• genin sonu
• Mutasyon yoluyla nakavt
Mutasyonla genetik nakavt
Genler genellikle bakterilerdeki mutasyonlarla alınır. Bu tekniği Escherichia coli’de kullanmanın erken bir örneği, 1989’da Hamilton ve arkadaşları tarafından uygulandı. Bu deneyde, bir geni silmek için iki ardışık rekombinasyon kullanıldı. Bu çalışma, bakterilerde fonksiyonel bir genin çıkarılmasının veya değiştirilmesinin uygulanabilirliğini göstermiştir. Bu yöntem o zamandan beri diğer organizmalar, özellikle fareler gibi araştırma hayvanları için geliştirilmiştir.
Kayıp fareler, hastalık için önemli olabilecek insan eşdeğerleri olan genleri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Nakavt farelerde yapılan yakın tarihli bir çalışma örneği, Xirp proteinlerinin ani açıklanamayan gece ölümü sendromu (SUNDS) ve Brugada sendromundaki rollerini Cheng ve diğerlerinde bir Han Çin popülasyonunda araştırdı.
Araştırmacılar, iki sendromlu kişilerde Xirp genlerini incelediler ve hastalığa neden olabilecek iki farklı gen türü belirlediler. Xirp2 farelerini kullanarak, Xirp2’den yoksun farelerin kalplerinde bir takım anormallikler olduğunu öğrendiler. Bu çalışma, SUNDS ve Brugada sendromunda rol oynaması muhtemel Xirp varyantlarının tanımlanmasına izin verdi ve Xirp2’nin kardiyak fonksiyondaki rolünü ortaya çıkardı.
gen susturma
Gen susturma veya RNA interferansı (RNAi), gen nakavt çalışmalarında popüler hale gelen daha yeni bir tekniktir. RNAi’de, belirli bir genin haberci RNA’sını bozmak için küçük karışan RNA (siRNA) veya kısa firkete RNA (shRNA) kullanılır. Bu, gen ekspresyonunu etkili bir şekilde bastırır. RNAi kullanarak gen susturma, Bcl-2 ve p53 gibi onkogenlerin yanı sıra nörolojik hastalıklar, genetik bozukluklar ve viral enfeksiyonlardan sorumlu genleri hedeflemek için kullanılmıştır.
koşullu nakavt
Gen silmeleri kullanan nakavt yöntemleri, erken gelişimde yer almayan genleri incelemek için güçlü olmuştur. Bununla birlikte, aktif genler genellikle erken gelişim sırasında organizma üzerinde ölümcül bir etki olmaksızın ortadan kaldırılamaz. Koşullu nakavt bunun bir yoludur. Orijinal koşullu nakavt yöntemi, LoxP olarak bilinen kısa hedef dizileri yeniden birleştiren Cre’ye özgü siteye özgü bir rekombinaz kullandı. O zamandan beri, koşullu nakavt çalışmalarında başka rekombinasyonlar geliştirildi ve kullanıldı.
Önceki yöntemlerden ikisini birleştiren Kuhn, 2010 tarihli bir makalede et al RNA’nın (shRNA) ekspresyonunu kontrol etmek için rekombinaz veya doksisiklin kullanarak farelerde gen sessizleştirmeye neden olan bir yöntemi açıklamaktadır. Yöntem, tekrar üretilebilir farelerin üretilmesiyle sonuçlandı.
gen düzenleme
Çinko parmak nükleazları (ZFN’ler), transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN’ler) ve kümelenmiş kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gibi gen düzenleme sistemleri, bölgeye özgü rekombinasyonun gelişmekte olan bir çeşididir. Bu enzimler, klonlama gibi moleküler biyolojideki birçok temel yaklaşımın yerini almaya başlıyor. Koşullu gen yıkımı, orijinal araçlara göre bazı avantajları olduğu için başka bir örnektir.
Genetik nakavt süreci
Genetik nakavt yönteminde bazı süreçlerin izlenmesi gerekir. Bu süreçler aşağıdaki gibidir:
Nakavt için Bir Gen Seçmek: Herhangi bir genetik mühendisliği deneyinde ilk adım, hedefin kişinin çalışmak veya işlevini anlamak istediği gen olduğu bir hedef seçmektir. Bundan sonra, ilgili gen ile ilgili yapı, uzunluk ve diğer parametrelerin incelendiği bazı kuru laboratuvar çalışmaları yapılır. Buna dayanarak, deney için en uygun plazmit seçilir. Ancak ondan önce söz konusu gen tanımlanır ve kromozomla eşlenir.
Vektör yapısı: Vektör, ilgilenilen bir geni veya başka bir DNA dizisini hedef hücrelere aktarmak için kullanılan bir araçtır, genellikle bunun için bir plazmit kullanılır. Bir plazmid, genetik mühendisliği deneylerinde kullanılan bir bakterinin ekstrakromozomal DNA’sıdır. BAC bakteriyel yapay kromozom vektörü, genomik nakavt deneylerinde kullanılır. DNA dizisine protein oluşumunu önleyen bir çerçeve kayması mutasyonunun eklendiğini varsayalım.
Bir genden bazı ORF’lerin yani açık okuma çerçevelerinin çıkarılması ve modifiye edilmiş bir genin BAC’ye eklenmesi işlemidir. Bu şekilde, sonuçları doğrulamak için işaretleyici DNA dizileri de eklenir ve bunun için genellikle bir antibiyotik direnç geni kullanılır. Bununla birlikte, replikasyon orijini, promotör dizisi ve tanıma dizisi gibi bazı diğer önemli DNA dizileri de plazmide eklenir. Plazmid artık dönüşüm için hazırdır.
Embriyonik kök hücrelere yerleştirme: Artık elektroporasyon, sonikasyon veya mikroenjeksiyon gibi endüstriyel yöntemler kullanılarak plazmid, embriyonik kök hücrelere verilir. Embriyonik kök hücreler daha hızlı bölünebilir ve her tür hücreye bölünebilir. Embriyonik kök hücreler, olgun fare dokularına farklılaşma yeteneğine sahiptir. Elektroforez yöntemi, genin elektrik akımı altında hücreye yerleştirildiği ve artık embriyonik kök hücrelerin plazmitinin hedef hücrelerin içine alındığı, bilim adamlarının gen yıkımı için kullandıkları en iyi tekniklerden biridir.
Hedef geni bulursa rekombinasyon gerçekleşir ve hedef gene bir mutasyon eklenir. Marker gen sekanslaması da kullanılır, böylece markör gen sekansı, mutant gen sekansı ile birlikte transforme edilen hücrelerin genomuna da dahil edilir. Dönüştürülen hücreler artık neomisin içeren ortam üzerinde büyütülür, böylece NeoR genini içeren hücreler büyüyebilir. NeoR içeren hücreler ile NeoR genini içermeyen hücreler arasında ayrım yapılabilir.
Giriş onayı: Hücreler laboratuvar koşullarında büyütüldüğünde, bazı hücrelerin dönüşmesi veya bazı hücrelerin değişmemesi mümkündür. Artık PCR kullanılarak ek kontrol edilebilir. Bunun için kültürlenmiş hücrelerden DNA elde edilir. Amplifikasyonu sağlamak için markörün DNA dizisine özgü bir dizi primer kullanılır. Amplikonlar gözlemlenirse hücreler dönüştürülür, aksi takdirde deneyimiz başarısız olur. Embriyonik kök hücrelerin başarılı bir şekilde dönüştürüldüğü varsayılırsa, bunlar transgenik hücreler olarak adlandırılabilir.
Embriyoya enjeksiyon: Dönüştürülmüş hücreler seçilir ve model organizmanın gelişmekte olan embriyosuna nakledilir. Normal büyümesine izin verilir.
Fare model seçimi: Model organizmanın embriyosunda biri vahşi tip diğeri modifiye (dönüştürülmüş) hücreler olmak üzere iki hücre popülasyonu vardır ve bu hayvana kimera adı verilir. Kimerik hayvan transgenik durumdadır, bir sonraki adımda iki farklı genotipin yavrularını üreten normal hayvanla çiftleştirilir ve başka bir hayvan elde edilir (artı heterozigot), bir normal homozigot veya değiştirilmiş bir genotip ile homozigottur.
Sonuç: Artık gen nakavtına sahip hayvan inşa edildiğine göre, bilim adamları onu inceleyerek söz konusu genle ilgili çeşitli parametreleri ölçebilir. Gen ile ilgili fiziksel, biyokimyasal veya genetik parametreler incelenebilir. Daha sonra, gen yıkımının sonuçları PCR amplifikasyon yöntemi kullanılarak doğrulanabilir.
Gen nakavt nasıl onaylanır?
Genetik nakavtın doğrulanması tüm deneyin önemli bir parçasıdır. Bunu yapmak için birçok farklı yöntem kullanılmış olsa da günümüzde popüler olan yöntemlerden biri polimeraz zincir reaksiyonudur. PCR, yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir ve çoğu deney için en güvenilir olanıdır. Burada, gen yıkımını doğrulamak veya onaylamak için iki set primer kullanılır. Bir primer seti, hedef sekansın yan bölgelerinden tasarlanır ve diğer primer seti, bir işaretleyici geni, yani antibiyotik dirençli geni sekanslamak için tasarlanır.
Deneyin ana çıktılarından biri hedef geni yeniden birleştirmekse, antibiyotik geni hedef genoma aktarılır. Bu nedenle, işaretleyici gen için tamamlayıcı bir primer seti ile bir PCR reaksiyonunda bir DNA dizisi elde edersek deneyimiz başarılı olur. Öte yandan, hedef gen çıkarıldıktan sonra, genlerin yan primerleri amplifiye edilemez ve DNA alanı elde edilemez. Bununla birlikte, primer set 1 kullanılarak bir DNA bandının elde edilebilmesi için kontrol reaksiyonu olarak vahşi tip DNA kullanılır. Amplifikasyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra, sonuçlar agaroz jel elektroforezi kullanılarak doğrulanır. PCR sonuçları %2’lik bir agaroz jel üzerinde görüntülenebilir.
Fareler neden genetik nakavt için seçilir?
Genin işlevini incelemek için yaratılmış, arızalı bir gene sahip farelere, nakavt fareler denir. Fareler, insan ve fare genleri arasındaki benzerlikler nedeniyle genetik mühendisliği ve nakavt çalışmalarında kullanılmaktadır. Bir insan ve bir farenin genleri %99 benzerdir, bu nedenle deneyde doğrudan insan embriyolarını kullanmak yerine fareleri kullanmak daha akıllıcadır. İnsan embriyoları üzerinde yapılan çalışmalarla ilgili birçok etik sorun nedeniyle, bilim adamları fareleri gen nakavt çalışmalarında kullanırlar.
kaynak:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29306897
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC534783
yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]
İlk Yorumu Siz Yapın