Mevcut birkaç ekstraksiyon yöntemi vardır ve bunlar, DNA’yı verimli bir şekilde ekstrakte etme yeteneklerinde farklılık gösterir. Dikkate alınması gereken faktörlerden bazıları, analiz edilecek örneğin türü, işleme için gereken süre, operatör müdahalesi, kontaminasyon riski ve kullanım zorluğu veya kolaylığıdır. Bu, başarılı adli DNA profillemesinin temelidir. Seçim yönteminin görevi, yalnızca DNA’nın her numuneden verimli bir şekilde ekstrakte edilmesini sağlamamalı, aynı zamanda amplifikasyon gibi diğer işlemlere müdahale edebilecek potansiyel inhibitörleri de ortadan kaldırmalıdır.
DNA ekstraksiyon teknikleri
DNA ekstraksiyonunda kullanılan en popüler teknolojilerden biri, DNA’yı bozulmaya karşı koruyan geçiş metali iyonlarını bağlamak için iyon değişimini kullanan bir şelatlama reçinesi olan Chelex’tir. Chelex yönteminin avantajı hızlı olması, çoklu tüp transferi gerektirmemesi ve toksik organik çözücüler kullanmamasıdır. Ana dezavantajı, amplifikasyon sürecine müdahale eden inhibitörleri ortadan kaldıramamasıdır. Numuneler inhibitörlerle işlendiğinde, proteinleri yok etmek ve DNA’yı hücreden serbest bırakmak için deterjanlar ve proteazlar içeren bir salin solüsyonu kullanılır. Hücrelerin tuzlu suda parçalanmasını gerektiren organik ekstraksiyon yöntemi önerilir.
Bu kokteyl, DNA’yı sulu fazda bırakan bir fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı kullanılarak ayrılabilir. Sulu fazdan ekstrakte edilen DNA, etanol çökeltmesi ile veya numunelerdeki DNA’nın daha fazla saflaştırılmasına ve konsantrasyonuna izin veren bir santrifüjlü filtre ünitesi kullanılarak konsantre edilebilir. Organik ekstraksiyon yönteminin avantajı, genetik materyalin zor örneklerden (bozunmuş ve/veya düşük miktarda DNA) elde edilebilmesidir. Ayrıca PCR inhibitörlerinin varlığını başarıyla ortadan kaldırabilir. Bu yöntem hala en güvenilir ve etkili yöntemlerden biri olsa da, çok zaman alıcıdır. Tehlikeli kimyasallar kullanır ve daha fazla uygulamalı çaba ve çoklu tüp transferleri nedeniyle artan bir kontaminasyon ve numunenin yanlış kullanımı riski taşır.
DNA karışımlarında diferansiyel ayrışma
Cinsel suçlarda toplanan kanıtların genetik analizi genellikle bir veya daha fazla katılımcının genetik profillerini içerir. Bu tür karışımlarda, bireylerin genetik katkısı genellikle eşit değildir. Bazı durumlarda, biyolojik karışım asgari düzeyde katkıda bulunur ve genellikle cinsel saldırı vakalarında suçludur. Bu vericinin genetik oranı, duyarlılığın sınırları veya reaksiyonun en büyük miktarda bileşen tarafından doygunluğu nedeniyle tespit edilmemiş olabilir. Çoğu durumda, oranlar 1:20’yi geçtiğinde, DNA karışımının küçük katkısı tespit edilemez.
Cinsel saldırı vakalarında kanıt elde etmek, adli DNA analistleri için büyük bir zorluktur. Çünkü DNA’nın epitel hücrelerinden (kurban) ve spermden (suçlu) ayrılmasını gerektirir. Diferansiyel ekstraksiyon ilk olarak Gill ve diğerleri tarafından 1986’da fenol ve organik kloroform ekstraksiyonunun bir modifikasyonu olarak tanımlandı. Buna diferansiyel lizis denir çünkü spermatin olmayan hücreler deterjanlar ve proteazlar tarafından seçici olarak hidrolize edilir. Spermatogonia’da, sperm başındaki proteaz tedavisine dirençli disülfit bağlayıcı ağır proteinler nedeniyle hücreler bozulmaz. Adli DNA laboratuvarlarında, diferansiyel lizis yöntemi uzun süredir spermi epitel hücrelerinden ayırmak için standart olmuştur. Bu teknik, daha önce bahsedildiği gibi teorik olarak iki haplotip üretebilse de, ayırma her zaman tam değildir ve karışık genotiplerle sonuçlanır.
Diğer DNA ekstraksiyon yöntemleri
Sperm ve epitel hücrelerini cinsel saldırı örneklerinden ayırmanın başka yolları da vardır. DIVIX™ sistem yöntemi, epitel hücrelerinin seçici proteinaz K sindirimini, ardından diferansiyel santrifüjleme ve faz ayırmayı içerir. Bu yöntemin DNA laboratuvarlarında kullanılması, karışık boyalardan sperm DNA’sı elde etmede iki adımlı yönteme eşit etkinlik sağladığını göstermektedir.
İnsan tanımlaması için moleküler yöntemler
Adli tıp ortamında DNA testinin ilk kullanımı 1986’daydı. İngiltere’nin Leicestershire kentinde 1983 ve 1986’da iki kız çocuğu cinsel saldırıya uğradı ve ardından vahşice öldürüldü. Bu vaka, bir masumun suçlandığını ve bir yıl sonra suçlunun bulunduğunu gösterdi. ve kararlı. Son 30 yılda, DNA’nın moleküler analizi, adli tıp araştırmalarında önemli bir araç haline geldi. Şu anda, DNA profillemesi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizlerine dayanmaktadır. Bu yöntem, otozomları ve Y ve X kromozomlarını içerir.PCR, bölgenin birçok kopyasını elde etmek için genom üzerindeki belirli bir bölgeyi tekrar tekrar kopyalama işlemidir.
DNA, PCR’den önce ölçülmelidir ve bu, doğru amplifikasyonunu sağlamak için kritik öneme sahiptir. Birincil amacı, izolasyon tarafından üretilen DNA şablonunu ölçmektir. Kesinliği değişen birçok yöntem vardır, ancak örneklerde bulunan DNA konsantrasyonunu bilmek, adli bilim insanının, artık bir genetik profil elde edilebilmesi için çoğaltmak için gereken ideal DNA miktarını belirlemesine olanak tanır. Cinsel suçlarda toplanan kanıtların genetik analizi genellikle bir veya daha fazla katılımcının genetik profillerini içerir. Bu tür karışımlarda, bireylerin genetik katkısı genellikle eşit değildir. Bu, muhtemelen PCR’yi etkilediği bilinen tercihli amplifikasyon gibi bir dizi stokastik etki yoluyla tanımlama sürecini daha da bozar.
Kısa ardışık fazlalık (STR) analizi
Mikro uydular veya STR’ler, art arda gelen bir nükleotit çekirdeği içerir ve bunların adli tıpta kullanılması, insan kimliğinin belirlenmesinde yeni bir yol açmıştır. STR’lerin oldukça değişken etiketleri nedeniyle yüksek derecede ayrımcılığa sahip oldukları bilinmektedir. Bu, faili olay mahallinde veya mağduru dahil etmek istendiğinde kullanışlıdır. Eserler, adli vakalarda yaygın bir sorundur. Eksiksiz ve doğru bir STR profili oluşturmak için genellikle biyolojik maddeler ve araçların sıralanması gerekir. Cinsel saldırı vakalarında genellikle parçalanmış DNA’yı gösteren biyolojik kanıtlar vardır. Ve PCR ürünleri daha küçük olduklarında daha etkili bir şekilde geri kazanılabilirler. PCR primerlerini STR bölgesine yaklaştırarak, aynı bilgileri korurken ürün boyutları küçültülebilir. Uygulamada, tehlikeye atılmış DNA örneklerinden bilgi kurtarma başarı oranları, geleneksel STR kitlerine kıyasla mini-STR sistemleriyle artar.
Cinsiyet kromozomları, bir kişinin biyolojik kökenini gösterir ve akrabalar arasında düşük dışlanma gücüne sahiptir. Y-STR belirteçleri, diferansiyel ekstraksiyonun mümkün olmadığı azospermik erkeklerde veya bunak cinsel yamalarda karışık heteroseksüel özellikler durumunda rol oynayabilir. X-STR etiketlerinin çeşitli adli uygulamaları vardır ve teyzeler, yeğenler ve kuzenler gibi yakın akrabalar arasında ilişki kurmak için kullanılabilir. Ayrıca, 13 set Y-STR’nin (hızlı değişen Y-STR’ler) erkek göreli farklılaşmasından daha büyük bir mertebeye ulaşabileceğini göstermek için teorik ve ön deneysel kanıtlar sunuldu. Bu neredeyse tamamen erkek münhasırlığının etkileri, adli tıp pratiğinde büyük ilgi görüyor. Örneğin, ara sıra haplotip eşleşmeleri nedeniyle masum bireylerin cinsel araştırmalara dahil edilmesini azaltmak için kullanılabilir.
Tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP’ler) analizi
SNP’ler, belirli bir noktada bireyler arasındaki temel dizilimdeki tek bir varyasyondur ve insan genomundaki milyonlarca bölgede bulunur. Bu, bireyleri birbirinden ayırabilecekleri anlamına gelir. SNP’ler, rastgele fenotipler göstermeyen bozulmuş DNA örneklerinden bilgi kurtarabilir. Numune işleme ve veri analizi, boyuta göre ayırmaya gerek olmadığı için daha otomatik hale getirilebilir. Ayrıca ırkı ve belirli fiziksel özellikleri tahmin etme yeteneğine de sahiptir. Adli DNA sınıflandırma uygulamalarında SNP’leri kullanmanın en büyük zorluğu, aynı anda az miktarda DNA’dan bir multipleks polimeraz zincir reaksiyonunda (PCR) yeterli sayıda SNP’yi amplifiye edememektir.
Tek bir SNP, çok alelik bir STR işaretleyicisinden daha az bilgi sağladığından, makul bir ayrım gücü elde etmek için daha fazla sayıda SNP analiz edilmelidir. Önceden, yüksek yoğunluklu SNP dizileri, yüz binlerce hatta milyonlarca SNP’nin paralel olarak analiz edilmesine izin veriyordu. SNP dizisinin temel ilkeleri, afinite DNA hibridizasyonu, floresan mikroskopisi ve katı yüzey DNA yakalamadır. SNP dizilerinin üç temel bileşeni, alele özgü oligonükleotit (ASO) probları içeren bir dizidir. Hedefin flüoresan boyalarla işaretlenmiş parçalanmış DNA dizisi, hibridizasyon sinyalini kaydeden ve yorumlayan bir algılama sistemidir. Bununla birlikte, bu diziler tipik olarak yüzlerce nanogram DNA gerektirir. Bunlar genellikle küçük biyolojik yamalardan üretilen adli vaka örneklerinden elde edilemez. Bu nedenle ata araştırmalarında da sıklıkla kullanılmaktadır.
Bialelik veya bialelik polimorfizmin başka bir biçimi, DNA’nın bir parçası olabilen nükleotitlerin veya indellerin eklenmesi ve silinmesidir. Çoğu INDEL, birkaç nükleotit uzunluk farkından oluşan alelleri gösterir. PCR amplikonları, yaklaşık 300 pg DNA şablonunun tam bir profilinin elde edilebildiği 160 bp’den az olacak şekilde tasarlanmıştır. Bununla birlikte, tüm INDEL’ler tüm popülasyonlarda çok faydalı değildir ve insan genomundaki kesin INDEL sayısı bilinmemektedir.
Hem SNP’ler hem de INDEL’ler artık tüm rutin adli tıp laboratuvarlarında bulunan araçlarda parça uzunluk analizine dayalı çoğullama kullanılarak yazılabilir. Bu, bayrağın kapsamını kullanılan STR’nin ötesine genişletmeyi mümkün kılar. Son yıllarda, analiz için güçlü bir alternatif sağlayan STR’lere yakın ayırt edici güçleri nedeniyle, birkaç SNP tabanlı haplotip sistemi adli tıp alanı için ideal belirteçler olarak denenmiştir. MH’ler, 200’den az nükleotitte 2 veya daha fazla polimorfizm içerir. Çok düşük rekombinasyon oranları, parçalanmış DNA ve karışık numune analizi durumlarında yararlı olan STR’lere benzer bir ayrım gücüne sahiptir.
Mitokondriyal DNA analizi
Mitokondriyal DNA (mtDNA) analizi genellikle Sanger dizileme kimyası kullanılarak yapılır. DNA dizilemesi hem ileri hem de geri yönde gerçekleştirilir. Böylece, tamamlayıcı iplikler kalite kontrol amacıyla birbirleriyle karşılaştırılabilir. Bugüne kadarki çoğu adli DNA çalışmasının odak noktası, genellikle HVI (HV1) ve HVII (HV2) olarak anılan oldukça değişken iki kontrol bölgesini içermektedir. Zaman zaman, test edilen numune hakkında daha fazla bilgi sağlamak için kontrol bölgesinin HV3 olarak bilinen üçüncü bir kısmı taranır. İnsan mitokondriyal DNA’sının kesinlikle anne tarafından kalıtıldığına inanılır ve genellikle baba bağlarında kullanılır.
Sperm hücresinin orta bölümü mtDNA içerir ve bu DNA otozomal DNA’dan daha dirençlidir. Çünkü küçük sirküler genomlarda mitokondriyal çift zar ve sirküler yapı bozunma süreçlerine karşı koruyucu faktör görevi görür. MtDNA’nın adli tıp uygulamaları, bozulmuş veya düşük miktarda DNA içeren numunelerin analizini içerir. Bu ikinci çar. Nicholas ve kardeşi Georgy Romanov’u tanımlamak için kullanıldı. Fiziksel ayırmanın yanı sıra, dişi mtDNA’nın birlikte amplifiye edilmediğinden emin olmak için erkek sekansa özgü primerler (SSP) kullanıldı. Primer tasarımı, bukkal sürüntülerin mtDNA analizinden sonra tanımlanan katılımcılar arasındaki mtDNA haplotip farklılıklarına dayanır. Bu prosedür, vajinal yaymada bulunan tek bir sperm hücresinden erkek mayoz paterninin karakterizasyonuna ve belirlenmesine izin verir. Yakın tarihli bir yaklaşımda, mtDNA’nın mikromanipülasyon tekniği ile vajinal kanaldaki sperm hücrelerini tanımlamak için kullanılabileceği gösterilmiştir.
kaynak:
europepmc.org/articles/pmc4637504
scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-31802002000300004
yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu
Diğer gönderilerimize göz at
[wpcin-random-posts]
İlk Yorumu Siz Yapın